[发明专利]一种以碳纳米材料为受体的上转换荧光共振能量转移检测方法

说明书

技术领域

本发明属于上转换荧光共振能量转移检测技术领域，具体涉及一种以碳纳米材料为受体的上转换荧光共振能量转移检测方法。

背景技术

目前生物样品中的生物分子的检测方法主要有异相分析和均相分析两种，现有的异相分析方法主要有酶联免疫分析、化学发光免疫分析和放射性免疫分析等。其中酶联免疫分析是在抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记的基础上进行的分析，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成有色产物，通过产物的量与受检物的关系进行定性或定量分析。现有的均相分析方法主要有时间分辨荧光免疫测定、下转换荧光免疫和上转换荧光共振能量转移检测。下转换荧光共振能量转移是一种基于供受体在距离足够近时的偶极-偶极相互作用的非辐射跃迁过程，是一种均相检测方法，可以克服异相分析所需的洗涤分离过程，操作简单，目前已经被用于疾病相关的生物分子的检测。时间分辨荧光免疫测定是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。上转换荧光共振能量转移利用上转换荧光纳米材料作为荧光共振能量转移体系的供体材料的均相分析方法，可以克服生物样品背景荧光的干扰，可用于复杂生物样品的检测，现有的基于上转换荧光共振能量转移的检测方法所采用的受体材料主要有有机染料、金纳米粒子。

但是这些方法都存在一定的缺陷：

（1）酶联免疫分析是一种异相分析方法，需要洗涤分离过程，操作繁琐、耗时，同时，酶联免疫分析还需要使用抗原抗体等蛋白，价格昂贵，检测成本高；

（2）下转换荧光免疫可以克服异相分析需要洗涤分离的缺点，但是却无法避免生物样品的背景干扰和光散射，限制其在复杂血液样本分析中的应用；

（3）时间分辨荧光免疫分析不仅可以克服异相分析分析需要洗涤分离的缺点，同时也可以避免生物样品的背景干扰和光散射，可用于复杂血液样本的分析检测，但是时光分辨荧光免疫分析的仪器价格昂贵，检测成本高；

（4）目前基于上转换荧光共振能量转移的检测方法所使用的受体材料主要是有机染料、金纳米粒子，其中有机染料作为猝灭剂时的猝灭能力较低，影响分析检测的灵敏度；金纳米粒子作为猝灭剂时需要进行表面标记。

发明内容

本发明克服现有技术的不足，提供一种以碳纳米颗粒为受体的上转换荧光共振能量转移检测方法。

一种以碳纳米材料为受体的上转换荧光共振能量转移检测方法，其特征在于以水溶性的上转换荧光纳米材料为荧光供体，以碳纳米材料为荧光受体，按下列步骤操作：

（1）制备水溶性的上转换荧光纳米材料并在其表面标记单链核酸、多肽或蛋白，将带有表面标记的上转换荧光纳米材料分散于缓冲液中，得到荧光供体溶液；

（2）制备碳纳米材料，将碳纳米材料分散于溶剂中，得到荧光受体溶液；

（3）将荧光供体溶液、荧光受体溶液和缓冲液按不同体积比混合后，得到荧光供体浓度相同、荧光受体浓度不同的各混合液，置于20～30℃孵育60～120min，在980nm激光器下测定各混合液的上转换荧光强度，得到荧光猝灭效率最大的混合液中所对应的荧光供体浓度和荧光受体浓度；

（4）标准曲线绘制：取荧光供体浓度和荧光受体浓度分别为荧光猝灭效率最大时所对应的浓度的混合液7组，置于20～30℃孵育60～120min后，以其中一组混合液为空白样，向其余各组混合液中分别加入已知浓度的目标物，再置于37℃孵育90～120min；在980nm激光器下测定各组混合液的上转换荧光强度，空白样的荧光强度为F₀，加入目标物的各组混合液的荧光强度为F，以（F-F₀）/F₀为纵坐标，目标物在混合液中的浓度为横坐标，绘制标准曲线；

（5）取步骤（4）所述荧光供体浓度和荧光受体浓度分别为荧光猝灭效率最大时所对应的浓度的混合液，20～30℃孵育60～120min，加入未知浓度的目标物样品，再置于37℃孵育90～120min后，测定混合液的荧光强度F_x，计算（F_x-F₀）/F₀的值，代入步骤（4）得到的标准曲线，再计算得到样品中目标物的浓度。

上述方案中，所述水溶性上转换荧光纳米材料为粒径30～100nm的球形纳米材料，其表面修饰有氨基或羧基。