[发明专利]一种Bt Cry71Aa1操纵子基因及其编码蛋白和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种Bt Cry71Aa1操纵子基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素。为了减少这些损失，多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类环境友好型微生物杀虫剂。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白（Insectididal crystal proteins，简称ICPs），ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。

自1981年Schnepf从菌株HD-1中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来，人们已经分离克隆了630多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性，它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N,et al.Microbiol Mol Biol Rev,1998,62:807-813;http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。现目前分为72个类群。一般而言,Cry蛋白都是由单个操纵元编码的，如Cry1,Cry2,Cry3,Cry4和Cry9等毒蛋白，这些基因编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kD;Cry54和Cry56等基因编码的杀虫晶体蛋白分子量为70-80kDa。随着对Bt杀虫基因研究的深入，一些具有两个操纵元编码的杀虫基因蛋白被予以发现，这些具有两个编码框的基因在第一个基因后面有一个具有相同编码方向的orf2共同组成这个基因的操纵子。这类操纵子基因由三个部分组成，分为cry基因编码60-80kDa Cry蛋白；由orf2编码的50-60kDa的蛋白,以及位于这两个蛋白之间的30-140bp的非编码序列。目前具有两个操纵元的杀虫基因蛋白有Cry5Ad1,Cry10Aa1,Cry19Aa1,Cry24Ba1,Cry39Aa1,Cry44Aa1,Cry44Aa1,Cry30Db1和Cry30Ba1。在以前的研究中这类的毒性蛋白只对蚊虫具有很好的杀虫活性。有些研究者认为orf2具有稳定cry mRNA的作用，或者其编码的ORF2蛋白可能作为一个分子伴侣，有助于cry蛋白晶体的形成（Rosso ML,1997.Appl Environ Microbiol63:4449-4455）；有些研究者则认为ORF2蛋白对于稳定晶体构型具有重要的作用（J.Eleazar Barboza-Corona,2012.Appl Environ Microbiol78(6):2005-2012），这类蛋白的形成可能是在进化过程中由于插入序列或者是点突变造成的。ORF2蛋白与Cry1、Cry4、Cry7、Cry8、Cry9等大分子量Cry蛋白的C端相类似，因此一些大分子的cry基因在进化过程中由于基因突变等因素造成完整的基因序列被分为两部分，形成由两个基因组成的cry操纵子基因（Thorne L,1986.J Bacteriology.166:801–811）。

分子伴侣是细胞中一大类蛋白质，是一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，但不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份。