[发明专利]用于与KRAS基因杂交的DNA探针库及采用其富集KRAS基因片段的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体而言，本发明涉及一种KRAS基因的富集和提取方法，所述方法可以精准地富集KRAS基因，进而可以选择性地进行KRAS基因结构突变的检测。 

背景技术

DNA测序技术正处在天翻地覆的剧变中，其突出特点为同时对众多的位点进行观察分析（大规模平行），从而逐步实现测序通量的大幅增长，原始数据中每个碱基的测序成本的急剧下跌。基于此，以前高不可攀的奢侈性活动（如个人基因测序、宏基因组学研究），逐渐变得越来越切实可行。特别是随着科学的发展，由于传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，下一代测序技术（第二代测序技术，Next-generation sequencing）应运而生。 

下一代测序技术是同步化三磷酸核苷酸的洗脱方法和同步化的光学检测方法的结合。例如采用以鲁米那（Illumina）提供的仪器，以短的连续性的片段序列和测序阅读长度的形式，每周输出数亿以计的碱基的DNA序列。这是一种由DNA连接酶和聚合酶主导化学过程的第二代测序方法，DNA序列将会用生物信息学的方法拼接还原。在成本方面，下一代测序技术比第一代测序技术大体上降低了1000倍，并且还正以指数级的速度下降。目前下一代测序技术已经广泛应用于全基因组测序，但是在其它基因分析领域，例如特定基因结构突变的检测等方面尚未得到充分开发。 

基因检测是利用血液、其他体液或细胞对核酸进行检测的技术，其通过特定设备对被检测者核酸分子信息作检测，分析它所含有的各种基因情况，从而使人们能了解自己的基因信息，判断身体患有疾病的情况或风险，从而可适应性地选择疾病治疗方案，甚至预防疾病的发生。 

现有的基因突变检测方法还主要集中于以下3个技术： 

1）PCR突变检测 

基于PCR片段扩增和凝胶电泳分离的方法，从而分辨出野生型和突变性的差异。其缺点包括：其为单碱基突变类型检测，不能对mRNA进行定量，不能检测基因颠换；敏感性低；耗时长，单次只能检测一个基因突变；不能确定碱基的具体变化；无法进行高通量检测。 

2）Q-PCR（定量PCR）检测 

基于荧光和PCR片段扩增来对模板mRNA多少来进行定量。其缺点包括：不能检测单碱基类型突变；不能检测基因颠换；只能检测已知突变；耗时长，单次只能检测一个基因突变；不能确定碱基的具体变化。 

3）基因芯片技术 

用高精度技术将DNA片段打印在芯片上，然后通过DNA杂交结合特性来确定突变性质。其缺点包括：不能检测基因颠换；只能检测已知突变；成本高，通量较小；准确率低，通常需要重复2次以上才能确定结果。 

因此可知，目前在基因检测技术方面尚缺少更为全面、快速、简便、准确的检测方法，特别是在目前拥有下一代测序技术这种以高通量、低成本基因测序为特点的技术的情况下，如何基于下一代测序技术开发新型基因检测和筛查技术，是本领域研究人员广泛关注的问题。并且，如果应用下一代测序技术来检测基因的结构突变情况，如何获得能够满足下一代测序技术要求的基因检测样本，也是期待解决的一个技术问题。 

RAS基因家族的基因有三种：分别定位在11、12和1号染色体上的HRAS、KRAS和NRAS。其中，KRAS突变比例最大，起开关作用，当正常时能调控细胞生长通路；发生异常时，则阻止细胞自我毁灭，并导致细胞的生长，增殖，和血管生成的过程。而且，由于KRAS在EGFR下游，KRAS变异细胞不受上游EGFR的信号影响，所以对抗EGFR治疗效果差。 

KRAS基因突变常见于大肠癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，子宫内膜癌和胆道癌。其中在胰腺癌中，KRAS基因的点突变发生率高达90%以上。KRAS基因的检测不仅可以深入了解具体KRAS基因变异的情况，更重要的是能够预测对于抗EGFR靶向治疗药物的反应。大量研究资料证实，KRAS基因突变状态与针对EGFR的药物的疗效有关，因此应用抗EGFR的药物时应该检测KRAS基因的突变状态。KRAS基因突变一般发生在早期，而且KRAS基因型一般不会再次产生变化。 

检测KRAS基因突变，对判断肿瘤的发生发展均有重要意义：正常人血 检出现KRAS基因变异，提示存在肿瘤易感性；良性肿瘤患者若带有KRAS基因突变，提示有恶变的可能；恶性肿瘤病人若KRAS基因突变阳性，即使病理组织学诊断淋巴结转移阴性，癌症复发的可能性也很高。 

发明内容