[发明专利]一种草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种双重荧光定量PCR检测试剂盒，具体涉及一种草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测试剂盒，进一步涉及了一种草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的双重荧光定量PCR的检测方法。

背景技术

草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）隶属水生呼肠孤病毒属，为呼肠孤病毒科一新成员，是中国大陆分离的第一株鱼类病毒。该病毒主要引起中国、越南、缅甸等亚洲国家淡水养殖中的草鱼品种在鱼种阶段发生出血病，死亡率可高达60%以上。该病毒流行广、危害大、死亡率高、发病季节长，严重威胁渔业生产。草鱼呼肠孤病毒具双层衣壳，病毒粒子平均直径为60 nm～70nm，二十面体对称，无囊膜，基因组由11条分节段的双链RNA组成。目前己经报道了20多个分离株，包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、GCRV H962、ZV-8802、GCRV-854、GCRV HZ08、GCRV JX09-01、GCRV JX09-02、GCRV GD10、GCRV GCRV104株等，不同分离株在基因组序列、基因组带型、细胞病变、对草鱼的致病力等方面差异较大。到目前为止，已完成全基因组序列分析的毒株有GCRV 873株、GCRV HZ08、GCRV GD10、GCRV 104等，也有比较多的毒株只完成了部分节段或者部分序列的测序工作。草鱼呼肠孤病毒比较复杂，不同分离株的各基因节段存在重配和抗原漂移现象，使得目前还没在血清学或者基因型上对其进行亚型分类。但是通过现有的分离株序列信息来看，至少应该有三类，各类的代表株分别是：第一类为873株和JX09-01株，第二类为HZ08株和GD10株，第三类型为104株。在相关的研究报道中已有提到将其进行基因分型的探讨，即分别把一、二和三类按照基因序列差异分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型（曾伟伟，王庆，刘永奎等.一株草鱼呼肠孤病毒弱毒株的分离、鉴定及免疫原性初步分析.水生生物学报,2011.35(5):790-795；曾伟伟, 王庆, 王英英, 张乐生, 刘宝芹, 石存斌, 吴淑勤.草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法的建立及其初步应用.中国水产科学.2013,20(2):329-335）。同一亚型的毒株，其对应各节段基因同源性均在95%以上。

当前，全国各地分离到的流行株中，三类亚型均有报道，有的单独感染，也有混合感染。根据近几年的草鱼出血病监测和流行病学调查分析表明，目前导致草鱼出血病流行和爆发的最主要为GCRV Ⅱ型，其次是GCRV Ⅰ型 ，而GCRV Ⅲ型几乎没有检测和分离到因此，根据草鱼出血病的流行特点和草鱼呼肠孤病毒分子生物学特性，根据同一亚型不同毒株之间共有的保守序列分别设计引物，建立针对目前主要流行基因型的草鱼呼肠孤病毒均能同时作诊断，并且可以鉴定其亚型的双重荧光定量RT-PCR快速、特异检测技术。

草鱼呼肠孤病毒的检测方法有多种，各具优势和缺陷，病毒分离、电镜观察、核酸带型分析至今仍是检测草鱼呼肠孤病毒普遍采用的方法，但这些方法费时费力、操作比较复杂，不能对病毒进行快速诊断，不利于草鱼出血病的流行病学调查工作。全病毒诊断涉及病毒培养、纯化及浓缩等过程，不仅制作过程复杂，耗时，成本较高，而且还潜在散毒危险，因此不利于推广使用。聚合酶链式反应（PCR）可以在数小时内对某片段基因进行扩大数百万倍。该技术特异性强，敏感性高、检测快速，已被广泛用于医学、微生物学、兽医学等学科的各领域。草鱼呼肠孤病毒不同毒株的RT-PCR检测方法已经广泛建立起来，该方法具有快速性、准确性和高灵敏性等优点，能够对草鱼呼肠孤病毒感染作出早期诊断，给疫情的快速分析和控制提供有力的技术支撑。其中的实时定量RT-PCR 检测平台作为简捷和可靠的草鱼呼肠孤病毒检测方法，不仅可以定性检测病毒的有无，而且可以定量分析病毒含量的多少，对于草鱼出血病的诊断和草鱼呼肠孤病毒的基础研究均具有重要的意义。多重荧光定量PCR是一种特殊荧光定量PCR形式，其最突出特点是一次PCR可同时检测多种病原，尤其适用于病原复杂或基因型较多的病原检测。

因此，建立能够同时对草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型进行快速检测的技术，不仅可以做到对不同亚型的草鱼呼肠孤病毒进行鉴别诊断和定量分析，而且可以简化操作程序、节约成本，对草鱼出血病的流行病学调查、病原监测及早期预警都具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测试剂盒。