[发明专利]鉴定宿主基因组中HBV基因整合位点和重复靶基因

说明书

技术领域

本发明涉及一种新颖的大规模锚定并行测序技术(massive anchored parallel sequencing，MAPS)，其可用于分离和测定HBV基因整合序列(即，整合子，integrant)、从而鉴定宿主基因组中HBV的基因整合位点和整合靶基因(targeted genes)；本发明还涉及用于实施该技术的试剂盒；本发明还涉及利用该技术确定的被HBV重复整合的(recurrently integrated)基因、以及这些基因的用途。 

背景技术

乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)的长期感染可以引起一系列肝脏疾病，包括慢性肝炎、肝硬化以及肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。全世界大约有20亿人受到HBV感染，其中3.5亿为慢性感染。HBV感染每年造成50万-120万人死亡，其中32万由HCC引起(Parkin2006)。很多流行病学研究发现，HBV慢性感染与HCC的发生发展存在因果关系(Szmuness1978)。由HBV引起的HCC中，约85-90％发现了HBV整合片段和游离的HBV基因组(Murakami，Saigo et al.2005)。 

大部分HBV相关的HCC中都发现了乙肝病毒DNA整合到宿主细胞的染色体上。在HCC的发生发展中，HBV基因整合的作用复杂，机理尚未完全明晰。HBV整合发现于宿主基因组的各个染色体上(Tokino and Matsubara1991)。这些整合可能导致染色体的改变、基因组的不稳定，或者改变人类基因的表达水平。HBV整合被认为与染色体脆弱位点或者重复序列相关，并在整合后导致局部的重组，因而使基因组变得更加不稳定(Feitelson and Lee2007)。 

病毒基因整合入宿主细胞基因组中引起整合靶基因形成诱发癌化的功能，是病毒感染引发癌症的经典机制。HBV插入的目标基因包括RARB(Garcia，de The et al.1993)和CCNA2(Wang，Zindy et al.1992)，整合后产生融合的原癌蛋白引起癌发生。类似的HBV整合激活靶基因癌化功能形成的报道还包括甲羟戊酸激酶(MK)(Graef,Caselmann et al.1994；Graef，Caselmann et al.1995)，羧肽酶N(CPN2)(Pineau，Marchio et al.1996)，肌质网/内质网钙蛋白(SERCA)(Chami，Gozuacik et al.2000)和端粒酶逆转录酶(TERT)(Horikawa and Barrett2001)。然而，上述基因中除了TERT外，其余靶基因整合还没有被发现在其它 HCC患者中重现。 

随着新一代测序技术的发展，全基因组测序已被用来研究全基因组范围内的HBV整合事件。Sung等人利用Illumina PE测序对81个HBV阳性的HCC样本进行超过30倍覆盖率的全基因组测序，根据2对测序结果同时比对上hg19和HBV的临近序列为整合位点认定标准，他们发现了399个HBV整合事件，平均每个病人4.9个整合，其中重复整合的靶基因有TERT(整合次数n＝18，即发现该基因在所有样本中被HBV整合18例)、MLL4(n＝9)、FN1(n＝5)、CCNE1(n＝4)、SENP5(n＝3)和ROCK1(n＝2)(Sung，Zheng et al.2012)。在另一篇最近的报道中，Jiang等人利用Complete Genomics测序技术以超过80倍的测序覆盖分析了3位HBV-HCC病人的基因组，鉴定到255个HBV整合位点，平均每个病人为64个整合事件，但没有发现重复整合靶基因(Jiang，Jhunjhunwala et al.2012)。Fujimoto等利用IlluminaPE测序在11例HBV相关的HCC样本中进行40倍覆盖率的全基因组测序，发现23个整合位点，其中一个重复整合靶基因TERT(n＝4)(Fujimoto，Totoki et al.2012)。