[发明专利]一种生产富含黃酮和多糖的雪莲培养物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产雪莲次生代谢产物的方法，具体地，涉及一种生产富含黃酮和多糖的雪莲培养物的方法。

背景技术

雪莲(Saussurea medusa Maxim)，是我国一种名贵植物药材，产于我国甘肃、青海、西藏、新疆等地的高海拔山区的雪域之中，具有散寒除湿、壮阳补血、抗炎镇痛等作用，民间用于治疗风湿性关节炎、阳萎、妇女月经不调、高山不适应症等。药理研究证明，雪莲具有抗风湿镇痛、强心、终止妊娠、清除自由基及抗疲劳、解痉、降压和平喘、抑制病毒复制、抑制染色体损伤、促进辐射损伤修复、促创面愈合抗炎等作用。最近日本研究人员发现，从雪莲提取的木质体(lignan)类化合物，具有抗HIV、抗肿瘤和降血压的作用。在新疆，雪莲药材每年的需求量在百吨以上，而天然雪莲资源已经严重匮乏，人工栽培还未成功，造成雪莲药材严重供不应求。为保护国家珍稀植物，中国已在2001年明令禁止采挖天然雪莲、肉苁蓉等植物，更造成了雪莲药材的短缺。

野生雪莲中有效成分—多糖类化合物含量低，通常只有干重的0.7%左右。为此，迫切需要解决药用雪莲资源问题。然而，通过人工培育解决雪莲资源问题是一种有效的途径，可是目前尚未见到有关用细胞培养高产雪莲多糖类化合物这方面的文献报道。

中国发明专利申请（公开号CN1340611A，公开日2002年03月20日，申请号00123740.3）公开了一种水母雪莲高产黄酮细胞系，用本发明提供的细胞系和培养基，其细胞生长速率为35～40g干重/升/月，黄酮类化合物的含量为培养物干重的6～7%，虽然具有较好的细胞生长特性和较高的生物合成黄酮的能力，但仍存在以下不足：(1)黄酮含量还较低；(2)细胞聚集培养尺寸大于Smm就可能导致黄酮含量的下降；(3)细胞的遗传稳定性较差。

中国发明专利申请（公开号CN1424395A，公开日2003年06年18日，申请号02156868.5）公开了一种建立稳定高产次级代谢产物黄酮的雪莲细胞系的方法，其利用60Co-γ射线照射、紫外光线照射等手段诱变处理原始雪莲细胞系，以提高雪莲细胞中黄酮的含量，获得了一株稳定高产雪莲细胞系，可连续传代50代，细胞的培养密度和黄酮含量一直维持在20g(干重)/L和12%左右，该细胞系适应能力强，可以在18℃～30℃环境中生长，最适培养温度范围为20℃～25℃，但是该专利文献未说明细胞聚集生长对黄酮合成的影响。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种生产富含黃酮和多糖的雪莲培养物的方法。本发明可稳定实现含黃酮和多糖等雪莲次生代谢产物的工业化生产，生产成本低，培养周期短，不受自然条件的影响。

本发明的目的通过以下技术方案实现，一种富含黃酮和多糖的雪莲培养物的生产方法，包括以下步骤：

步骤（1），雪莲种子经过萌发获得雪莲植株，将所述雪莲植株作为外植体，先用自来水冲洗，然后用杀菌剂浸泡杀菌，再用无菌水冲洗，然后接种于含植物激素的1/2MS培养基上24～26℃培养，经12～15d培养后，即可在外植体的切口部位形成愈伤组织，将所述愈伤组织在基本培养基上经过继代培养，每12～15d转代一次，选取浅红色愈伤组织的细胞系为高产雪莲黃酮和多糖的细胞系；

步骤（2），将所述细胞系在添加秋水仙碱的基本培养基中进行培养获得雪莲多倍体细胞系；

步骤（3），将所述雪莲多倍体细胞系接种于合成培养基中培养得到富含雪莲黃酮和多糖的细胞，即得。

优选的，步骤（1）中，所述1/2MS培养基上24～26℃培养为无光照的暗培养。

更优选的，步骤（1）中，所述无菌水冲洗的次数为5～6次，每次2～3分钟。

更优选的，步骤（1）中，所述植物激素为生长素和/或细胞分裂素，进一步优选的，所述生长素为2,4-二氯苯氧乙酸或萘乙酸，所述细胞分裂素为6-苄基腺嘌呤或激动素。

更优选的，步骤（2）和步骤（3）之间还包括以下步骤：将所述雪莲多倍体细胞系进行扩增培养。

在本发明中，在有光照条件下可以获得雪莲高产多糖细胞系，但是在暗培养条件下，获得的雪莲高产多糖细胞系效果更好。

本发明的雪莲细胞系具有以下特征：颜色为粉红色，结构紧密，黄酮含量为细胞干重的15～20%左右，细胞聚集生长的大小为5～30mm，细胞的培养密度可达23～25g（干重）/L培养基，黄酮产量一般为2.5～3.Og/L培养基，该细胞系可用于制各中药原料药雪莲黄酮和多糖等雪莲次生代谢产物。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：