[发明专利]一种抗玉米矮花叶病RNAi载体的构建及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种RNA干扰（RNAi）载体，特别涉及一种抗玉米矮花叶病的RNAi载体。

背景技术

玉米矮花叶病（Maize dwarf mosaic，MDM）在我国玉米上发生普遍，是玉米生产中面临的一个重要问题。引起我国玉米矮花叶病的毒原主要是甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）。SCMV属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus），在自然界中主要通过蚜虫和种子传播，侵染甘蔗和玉米等禾本科作物。SCMV的基因组由一条正单链RNA分子组成，有一个大的开放阅读框（ORF），可表达产生一个多聚蛋白，然后经翻译切割成10个成熟蛋白。我国玉米上发生的SCMV大多属于MDB株系。但近年在山东、河北等地还出现了一个国内外未见报道的新株系，可以侵染我国大多数主栽玉米品种。

种植抗病品种是防治玉米矮花叶病最有效的措施。但在培育抗病品种时面临选育周期长、抗病基因匮乏及病毒变异会导致寄主抗病性丧失等问题。利用RNAi技术，通过基因工程手段可以在较短时间内获得抗病毒材料。

RNAi是真核生物体内发生的、基于核酸序列同源性的一种基因表达调控机制。双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）是RNAi起始的关键因子。它首先被Dicer酶降解为3′-端具有2nt突出的21-26nt的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），后者整合入RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），并指导RISC对同源RNA进行识别和切割，最终导致RISC降解靶标mRNA。

形成dsRNA的有效途径之一是将体外构建的反向重复结构（inverted repeats，IR）转入植株。转入植物的反向重复序列在植物体内转录形成dsRNA后，启动RNAi，可有效控制与转基因有同源性的入侵病毒。反向重复结构由一段间隔序列（spacer）连接两段反向互补序列构成，转录后会形成发夹状RNA（hairpin RNA，hpRNA）。hpRNA由茎（stem，是反向互补序列转录的RNA配对形成的双链）和环（loop，是由spacer转录的RNA单链结构）组成。hpRNA中的茎是诱发序列特异性基因沉默的关键部份，茎的长短影响RNA沉默的效率和稳定性，植物中50-1000bp的dsRNA同源片段均能高效诱发转录后基因沉默。转化IR获得的抗病植株比例和抗病程度高于转正义或反义基因。

RNAi的效率还取决于IR的茎与入侵病毒核酸一致率的高低。转基因与入侵病毒基因组核苷酸一致率越高，则抗病效果越好。植物RNA病毒在自然界中是以准种形式存在，同一种病毒的基因组可能有一定程度的变异。在构建RNAi载体时，需要针对不同病毒找到最保守的基因，筛选最有效的片断作为靶标。

应用RNAi技术培育抗甘蔗花叶病毒的玉米植株，可为有效控制玉米矮花叶病提供帮助。

发明内容

基于上述原因，发明人在分析引起我国玉米矮花叶病的SCMV基因组群体结构的基础上，从其CI、NIb和CP等基因中筛选到诱导RNAi最有效的3个片段，其序列分别如Seq ID No.2、Seq ID No.3和Seq ID No.4所示，其中CI位于SCMV BD8全序列中的4878-5430bp，NIb位于全序列的7652-7892bp，CP位于全序列的9008-9303bp，具体如下表：

根据上述的三个片段，发明人通过融合PCR构建反向重复序列，通过NcoI/BstEII双酶切将反向重复序列插入双元表达载体pCAMBIA3301，从而获得了针对甘蔗花叶病毒的RNAi载体p3301-SCMVCINIb1CPRi。将该载体转化玉米，获得了对矮花叶病有良好抗性的转基因玉米植株。

本发明所提供的RNAi载体p3301-SCMVCINIb1CPRi转化大肠埃希氏菌(EC3301-SCMVCINIb1CPRi)后保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

保藏信息

保藏时间：2010年11月22日

保藏单位名称：中国普通微生物保藏管理中心CGMCC

保藏编号：CGMCC NO.4356

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 中科院微生物研究所

分类命名:大肠埃希氏菌（Escherichia coli）