[发明专利]酶-孔构建体

权利要求书

1.一种用于检测核苷酸向核酸链的添加的方法，包括

(a)在存在孔的情况下，使所述核酸链与(i)聚合酶和(ii)经标记的核苷酸接触，从而使得当核苷酸添加至所述核酸链时，磷酸标记物质依次释放，其中所述磷酸物质含有对每种核苷酸特异的标记物；和

(b)使用所述孔检测所述磷酸标记物质，并从而检测所述核苷酸向所述核酸链的添加。

2.权利要求1所述的方法，其中所述孔结合至所述聚合酶。

3.权利要求2所述的方法，其中所述孔共价结合至所述聚合酶。

4.权利要求2所述的方法，其中所述孔在紧密接近所述孔的桶状体或通道的开口的位点处结合至所述聚合酶，并且/或者其中所述聚合酶结合至所述孔从而使得所述酶的活性位点朝向所述孔的开口。

5.权利要求1所述的方法，其中所述磷酸标记物质是通过以下方式检测：使所述物质与所述孔接触从而使得所述物质依次与所述孔反应，并且测量每次反应期间通过所述孔的电流。

6.权利要求1所述的方法，其中所述方法用于测序所述核酸链，并且所述方法还包括(c)使用所述核酸标记物质的顺序来确定所述核酸链的序列。

7.权利要求1所述的方法，其中所述孔来源自α-溶血素。

8.权利要求7所述的方法，其中所述孔包括七个亚基，基于氨基酸同一性，每个亚基与SEQ ID NO:2在其整个序列上具有至少55%的同源性。

9.权利要求8所述的方法，其中至少一个亚基在SEQ ID NO:2的139位上具有谷氨酰胺，在SEQ ID NO:2的113位上具有精氨酸或者在SEQ ID NO:2的119、121或135位上具有半胱氨酸。

10.权利要求9所述的方法，其中(a)全部7个亚基均在SEQ ID NO:2的139位上具有谷氨酰胺并且所述亚基之一在135位上具有半胱氨酸，并且/或者(b)全部7个亚基均在SEQ ID NO:2的113位上具有精氨酸。

11.权利要求1所述的方法，其中所述孔包括有利于所述孔与所述标记物质之间的相互作用的分子衔接体。

12.权利要求11所述的方法，其中所述分子衔接体为环糊精或其衍生物，七-6-氨基-β-环糊精(am₇-βCD)、6-单脱氧-6-单氨基-β-环糊精(am₁-βCD)或七-(6-脱氧-6-胍基)-环糊精(gu₇-βCD)。

13.权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶为(a)酶分类(EC)组2.7.7.6、2.7.7.7、2.7.7.19、2.7.7.48和2.7.7.49的任一组的成员，或(b)依赖DNA的DNA聚合酶、依赖RNA的DNA聚合酶、依赖DNA的RNA聚合酶或依赖RNA的RNA聚合酶。

14.权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸用荧光分子、放射性同位素、酶、抗体、抗原、多核苷酸或配体标记。

15.一种用于检测核苷酸向核酸链的添加的试剂盒，包括孔、聚合酶和经标记的核苷酸。