[发明专利]结瘤因子水解酶、其编码基因及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种结瘤因子水解酶、其编码基因及应用。

背景技术

氮是植物生长和发育必不可少的营养元素，农作物的产量在一定程度上依赖于植物可利用氮（NH₄⁺ 及NO₃^-）的获取量。最近半个世纪以来，化学合成氮肥被广泛应用于农业增产。但是过量使用氮肥不仅需要消耗大量的化学能源，引起土壤酸化和水体富营养化，也会导致相当量的氮流失以及由细菌反硝化作用引起的N₂O增加，从而导致温室效应及臭氧层破坏，进而严重破坏生态平衡。不利于我国的国民经济可持续发展。

相对于化学合成固氮，生物固氮是一种高效且环境友好型的固氮方式。根瘤菌是一种典型的生物固氮菌，它能够与豆科宿主植物共生并形成根瘤，将N₂固定并转化为植物可利用的氮素。此生物固氮体系能极大程度地提高氮的利用效率，增加粮食作物的产量，减少能源的消耗和减少对环境的污染，是一种可持续的发展方式。

根瘤菌与豆科植物共生互作的过程中，植物根部会形成“根瘤”这种复杂和独特的器官。根瘤菌在根瘤里利用固氮酶将N₂转化为植物可利用的NH₄⁺。同时，植物会为根瘤菌提供由光合作用产生的碳水化合物，两者互利共生。然而这种固氮机制具有宿主特异性，根瘤菌的入侵以及植物根瘤的形成涉及到两者之间复杂而微妙的应答机制，由许多因子共同决定。由根瘤菌分泌的结瘤因子（Nod factors）是最重要的共生决定因子，它是一种脂质几丁质寡聚糖，其结构会因根瘤菌的菌株差异而有所不同。例如，中华苜蓿根瘤菌产生的结瘤因子通常由一条含二个不饱和键的十六碳脂肪酸链连在一个四糖或五糖的碳骨架上，此外还会有一个硫酸基团结合在糖骨架的还原性末端，部分类型的结瘤因子还会有一个乙酰基团结合在糖骨架的非还原性末端。

来自糖基水解酶家族18的类V型几丁质酶——结瘤因子水解酶（MtChit5）不具备任何几丁质酶特征但却能够高效地水解中华苜蓿根瘤菌分泌的结瘤因子，表明该水解酶在结瘤共生中具有重要作用。因此，研究生物固氮相关基因及其所编码水解酶对建立农业的可持续发展具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种新的结瘤因子水解酶。

本发明的另一个目的在于提供编码上述结瘤因子水解酶的基因。

本发明的另一个目的在于提供含有上述结瘤因子水解酶编码基因的克隆载体和表达载体。

本发明的另一个目的在于提供一种生产上述结瘤因子水解酶重组蛋白的方法。

本发明的另一个目的在于提供上述结瘤因子水解酶及其编码蛋白的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种结瘤因子水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后仍具有结瘤因子水解酶活性的衍生蛋白。

编码上述结瘤因子水解酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种克隆载体，其含有编码上述结瘤因子水解酶的基因。

一种表达载体，其含有编码上述结瘤因子水解酶的基因。

一种生产结瘤因子水解酶的方法，包括将含有编码结瘤因子水解酶基因的表达载体导入宿主细胞中，表达得到结瘤因子水解酶。

所述宿主细胞为大肠杆菌。

以上所述的结瘤因子水解酶在水解结瘤因子上的应用。

以上所述的结瘤因子水解酶在研究豆科植物与根瘤菌互作机制或在研究豆科转基因植物上的应用。

以上所述的编码结瘤因子水解酶的基因在研究豆科植物与根瘤菌互作机制上的应用。

本发明的有益效果是：本发明发现了一种新的苜蓿结瘤因子水解酶（MtChit5）及其编码基因，重组表达得到的结瘤因子水解酶能够高效地将结瘤因子水解为脂质几丁质二糖和带硫酸基团的几丁质寡聚糖，这为进一步研究豆科植物与根瘤菌互作过程中的机制提供了新的理论与实践基础。

附图说明

图1为截形苜蓿MtChit5基因的PCR扩增产物的电泳图 (1为MtChit5，2为DNA分子量标准品)；

图2为重组结瘤因子水解酶MtChit5的SDS-PAGE检测图（1为标准蛋白样品，2为未引入MtChit5基因的空载体对照，3为蛋白粗提取物，4为纯化后的重组蛋白MtChit5，分子量为39 kDa）；