[发明专利]一种在禽细胞中检测流感病毒RNA聚合酶活性的报告基因质粒及其应用

权利要求书

1.一种质粒，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的质粒在制备检测病毒RNA聚合酶活性的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的病毒为流感病毒。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述流感病毒为猪流感病毒、禽流感病毒和/或人流感病毒。

5.根据权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于：所述猪流感病毒为猪H1N2流感病毒，所述禽流感病毒为禽H9N2流感病毒，所述人流感病毒为人H1N1流感病毒。

6.根据权利要求2-5任一所述的应用，其特征在于：所述检测病毒RNA聚合酶活性为检测所述病毒的RNA聚合酶在禽细胞中的RNA聚合酶活性。

7.一种用于检测病毒RNA聚合酶活性的试剂盒，包括权利要求1所述的质粒、内参质粒pCMV/SEAP、禽细胞、分别连接待测病毒RNA聚合酶中PB1蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述分别连接待测病毒RNA聚合酶中PB1蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒，是将所述待测病毒RNA聚合酶中PB1蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白或待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白的基因分别插入pcDNA3.1(+)的多克隆位点得到的；

所述禽细胞为禽DF1细胞。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括检测Gaussia荧光素酶活性的产品和检测分泌型碱性磷酸酶活性的产品。

10.一种检测待测病毒RNA聚合酶在禽细胞中RNA聚合酶活性的方法，是利用权利要求7-9中任一所述的试剂盒进行检测的，包括如下步骤：

将权利要求1所述的质粒、内参质粒pCMV/SEAP、分别连接待测病毒A的RNA聚合酶中PB1蛋白、待测病毒A的RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒A的RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒A的RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒共同转入所述禽细胞中，培养36小时，收集细胞培养液上清，检测细胞培养液上清中Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性，计算Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性的比值，记作a；

将权利要求1所述的质粒、内参质粒pCMV/SEAP、分别连接待测病毒B的RNA聚合酶中PB1蛋白、待测病毒B的RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒B的RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒B的RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒共同转入所述禽细胞中，培养36小时，收集细胞培养液上清，检测细胞培养液上清中Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性，计算Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性的比值，记作b；

将权利要求1所述的质粒、内参质粒pCMV/SEAP共同转入所述禽细胞中，培养36小时，收集细胞培养液上清，检测细胞培养液上清中Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性，计算Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性的比值，记作对照比值；

若a显著大于对照比值，则判定所述待测病毒A的RNA聚合酶在禽细胞中具有RNA聚合酶活性；

若a和b显著大于对照比值，并且a显著大于b，则判定病毒A在禽细胞中的RNA聚合酶活性大于病毒B在禽细胞中的RNA聚合酶活性；

所述待测病毒为流感病毒。