[发明专利]miR-493基因在制备抑制癌细胞增殖药物中的用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地讲，涉及miR-493基因在抑制非小细胞肺癌细胞增殖中的应用。 

背景技术

microRNAs（miRNAs）是一类进化上保守、长约19-25个核苷酸的非编码小分子RNA。Lee及Reinhart等相继在线虫中发现具有基因调控作用的非编码单链RNA分子，lin-4和let-7。随后大量的研究发现在各种生物体中均存在这种小分子RNA，它们具有组织特异性和时空性。这种具有基因调控作用的非编码小RNA分子被称作 microRNAs（miRNAs）。miRNAs以完全或不完全互补配对的方式与靶基因的mRNA 的3’端非翻译区（3’UTR）结合，导致靶mRNA的降解或者抑制其翻译，进而对功能基因的表达发挥精细调控功能。miRNAs参与各种细胞进程，如分化、增殖、凋亡以及应激反应。此外，它们还是某些肿瘤的关键调节点。自2002年Calin等首次发现miRNAs与B细胞慢性淋巴性白血病有关后，miRNAs与肿瘤的关系备受关注。此后的大量研究都表明miRNAs与多种肿瘤（肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等）的发生发展密切相关，在肿瘤细胞的增殖、血管发生、EMT、肿瘤细胞的侵袭与转移、耐药以及肿瘤干细胞等生物学功能中起着重要的调节作用。在此基础上，寻找miRNA在特定时空中的靶基因，揭示其作用机制是目前研究的重点，也是进一步阐述肿瘤发生发展机制、识别和鉴定新的肿瘤标志物的重要研究手段。 

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，近十年其发病率和死亡率均迅速上升，在我国高居恶性肿瘤死亡率的首位，已成为严重威胁人们生命健康的重大疾病。根据肺癌的生物学特性，分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC），其中NSCLC约占80-85%，近年来，随着治疗方式的改进，治疗方案的调整，肺癌的治疗取得了长足的进步，但是大部分的NSCLC患者预后仍然较差，5年生存率仍低于15%。缺乏有效的针对肺癌的早期诊断和治疗手段是导致肺癌患者死亡的最主要原因之一。miRNA通过调控靶基因的mRNA翻译，在肺癌的发生发展及转移中发挥重要作用。miRNA可能成为新的肺癌早期诊断和进展相关标记物，有助于肺癌的准确诊断及个性化治疗。 

发明内容

本发明的目的是提供一种可以有效抑制癌细胞增殖的药物。 

发明通过以下技术方案实现上述目的。 

发明提供了miR-493基因或含有该基因的表达载体在制备抑制癌细胞药物中的用途。所述的药物为抑制癌细胞增殖的药物。 

进一步地，所述的癌细胞的增殖机制与E2F1相关。 

作为优选的方案，所述的癌为肺癌、卵巢癌、头颈部肿瘤等。更优选地，癌细胞为非小细胞肺癌。进一步优选地，所述的癌细胞为95D。 

所述的miR-493基因序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。 

所述的药物的制剂形式可以是常规的制剂，如液体制剂、颗粒剂、片剂或胶丸。其还包括要学上可接受的载体。 

发明同时提供了miR-493基因或含有该基因的表达载体在制备E2F1抑制剂中的用途。 

本发明首次提供了miR-493基因作为在癌中抑制肿瘤增殖新的应用，为抗肿瘤药物的设计和筛选提供了新的靶点。本发明的研究思路进一步简述如下： 

发明人首先利用RT-PCR检测2株正常细胞和6株肺癌细胞miRNA的表达，发现相比于正常肺细胞，miR-493在肺癌细胞中普遍低表达，以高转移潜能的非小细胞肺癌95D细胞株尤为明显。

进一步，构建miR-493过表达慢病毒载体pEZX-MR03/eGFP-miR-493（该载体带绿色荧光蛋白）及空白对照载体，分别转染95D细胞，建立过表达miR-493的稳定细胞系95D/miR-493，以及对照组95D/control。并用实时荧光定量PCR验证转染效果。应用平板克隆形成实验、细胞生长曲线检测各组细胞的增殖能力，流式分析细胞周期，发现肺癌细胞的增殖能力明显受抑制。 

进一步，利用生物信息学在线预测软件分析并结合生物学功能，筛选出miR-493可能的靶基因。采用实时定量PCR、WesternBlot技术检测靶基因的表达，并将miR-493的成熟序列minics和重组有靶基因的3’UTR区序列的双荧光素酶报告基因共转染HEK293细胞，24h后检测荧光素酶报告基因的活性。同时利用RNAi技术干扰肺癌细胞中靶基因的表达水平作为对照。