[发明专利]一种在犬细胞中检测流感病毒RNA聚合酶活性的报告基因质粒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种在犬细胞中检测流感病毒RNA聚合酶活性的报告基因质粒及其应用。

背景技术

犬流感是由犬流感病毒引起的犬的高度接触性传染病。患犬往往表现出咳嗽、肺炎等感冒症状。近年来，犬流感病毒感染的报道迅速增多，犬是人类重要的伴侣动物，犬的健康越来越受到人们的重视。此外，犬中的流感病毒可能通过人-犬的亲密接触而增加感染人的机会。因此，犬流感病毒不仅影响犬的健康，也对公共卫生安全构成了严重威胁。

流感病毒的聚合酶基因在其致病性、宿主适应性及跨种间传播等多个生物学特性方面有重要作用。有研究发现，较高的聚合酶活性是产生高致病性毒株的一个重要决定因子，病毒聚合酶活性增强，致病性伴随着增强；更有报道，某些聚合酶基因影响着病毒在人群中的传播能力。另外，聚合酶活性在一定程度上也能反映RNP各基因片段之间的兼容程度。有研究证明限制病毒重排的一个关键因素是RNP复合体的兼容性，而其RNP的兼容性正与其相应的聚合酶活性相关。所以，流感病毒的聚合酶基因对这些生物学特性的影响与聚合酶活性有很大的关系，聚合酶活性对病毒的产生和复制能力有重要影响。

传统的流感病毒聚合酶活性测定是采用双报告基因检测系统，报告基因分别是海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶，由于海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶不能分泌到细胞外，需要裂解细胞以测定荧光素酶的表达量，操作不方便；另外，以往用的报告基因质粒上多是人源启动子，无法准确的反应病毒聚合酶在犬细胞上的聚合酶活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种在犬细胞中检测流感病毒RNA聚合酶活性的报告基因质粒及其应用。

本发明提供的一种质粒，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述质粒在制备检测病毒RNA聚合酶活性的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述的病毒为流感病毒。

上述任一所述的应用中，所述流感病毒为猪流感病毒、禽流感病毒和/或人流感

上述任一所述的应用中，所述猪流感病毒为猪H1N2流感病毒，所述禽流感病毒为禽H9N2流感病毒，所述人流感病毒为人H1N1流感病毒。

上述任一所述的应用中，所述检测病毒RNA聚合酶活性为检测所述病毒的RNA聚合酶在犬细胞中的RNA聚合酶活性。

上述任一所述的应用中，所述犬细胞为犬MDCK细胞。

一种用于检测病毒RNA聚合酶活性的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包括上述质粒、内参质粒pCMV/SEAP、犬细胞、分别连接待测病毒RNA聚合酶中PB1蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒。

上述试剂盒中，所述分别连接待测病毒RNA聚合酶中PB1蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒，是将所述待测病毒RNA聚合酶中PB1蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白或待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白的基因分别插入pcDNA3.1(+)的多克隆位点得到的；

所述犬细胞为犬MDCK细胞。

上述任一所述的试剂盒中，所述试剂盒还包括检测Gaussia荧光素酶活性的产品和检测分泌型碱性磷酸酶活性的产品。

一种检测待测病毒RNA聚合酶在犬细胞中RNA聚合酶活性的方法也属于本发明的保护范围，该方法是利用上述任一所述的试剂盒进行检测的，包括如下步骤：

将上述质粒、内参质粒pCMV/SEAP、分别连接待测病毒A的RNA聚合酶中PB1蛋白、待测病毒A的RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒A的RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒A的RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒共同转入所述犬细胞中，培养36小时，收集细胞培养液上清，检测细胞培养液上清中Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性，计算Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性的比值，记作a；

将上述质粒、内参质粒pCMV/SEAP、分别连接待测病毒B的RNA聚合酶中PB1蛋白、待测病毒B的RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒B的RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒B的RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒共同转入所述犬细胞中，培养36小时，收集细胞培养液上清，检测细胞培养液上清中Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性，计算Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性的比值，记作b；