[发明专利]文昌鱼识别几丁质的丝氨酸蛋白酶CASP基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及文昌鱼特有的MASP类似基因（命名为CASP基因）及其编码的CASP蛋白，以及该基因和蛋白在制备治疗感染性疾病的药物上的应用，属于基因工程领域。

背景技术

补体激活的凝集素途径是先天性免疫的一种重要防御措施，在生物体内发挥着重要的生物学功能，如溶胞作用、溶菌作用、调理作用及介导炎症反应。

激活凝集素途径的复合物是由一系列的模式识别分子以及相关的丝氨酸蛋白酶家族决定的。最早报道的甘露糖结合凝集素（Mannose Bindig lectin,MBL）激活补体途径的发现是在20多年前，从此，补体系统在先天性免疫中重要性重新被认识。而目前研究结果表明，MBL相关的丝氨酸蛋白酶(MASPs)：MASP1and MASP2,是参与激活补体系统的重要组成部分。

在病原体的感染时期，MASP在凝集素途径的产生和激活中扮演着重要角色，MASP-2是补体凝集素溶血途径中的重要一员，激活补体凝集素溶血途径中发挥着至关重要的作用。已有的研究表明：MASP2基因的突变和血清含量变化的多少与多种疾病密切相关（自身免疫性疾病，感染性疾病，肿瘤等）。MASP2缺陷,会导致凝集素途径的溶血活性缺失,导致化脓性感染；炎症性肺部疾病,也会导致MASP有关的补体途径损伤。同样的，MASP1缺陷，会导致胚胎细胞移行信息的潜在性丧失,表现为发育性综合征，包括面部异常,唇裂或/腭裂,颅骨缝早闭,学习障碍，生殖器,四肢和泌尿系统畸形,即所谓的3MC综合症；MASP1突变，也会导致其有关的补体途径损伤。

文昌鱼（Branchiostoma belcheri），属于脊索动物门（Chordate），头索动物亚门（cephalochordate），是现存和脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物。本发明的发明人从文昌鱼中克隆得到了全新的分子，将其命名为CASP（chitin-binding associated serine protease），该分子C端拥有和MASP同源的CCP和Tryp_SPc结构域，与MASP不同的是，其N端是一个几丁质结合结构域（CBD），这类分子在其他物种中从未报道，因此发明人推测其是文昌鱼所特有的MASP家族成员，并且担负着模式识别的功能。本发明的发明人对其蛋白进行了表达并制备了单抗，结果发现CASP内源蛋白能够结合几丁质糖，免疫胶体金的结果显示其能够识别和结合到金黄色葡萄球菌和大肠杆菌上，并且重组表达的该蛋白具有丝氨酸蛋白酶活性，并且拥有调理素的功能，能够显著地促进巨噬细胞对金葡菌的吞噬率。因此以上结果提示CASP在对抗外来病原中起着重要作用，具有成为高效天然抗菌药物的开发价值。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种新的类MASP家族免疫相关的基因，将其命名为CASP基因，同时还提供该基因所编码的蛋白。

本发明的另一个目的在于提供CASP基因所编码蛋白质的表达方法。

本发明再一个目的在于提供该蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。

一种文昌鱼识别几丁质的丝氨酸蛋白酶CASP基因，所述CASP基因是通过兼并引物扩增和RACE扩增的方法，从文昌鱼总RNA中克隆得到的一个MASP类似基因，其DNA序列如序列表中序列1所示。

由CASP基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如序列表中序列2所示；该蛋白等电点为5.28，分子量为46834.0道尔顿。

所述的蛋白质通过重组表达载体PET-32a(+)-CASP，在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达。表达方法具体包括以下步骤：

(1)构建重组表达载体PET-32a(+)-CASP；

(2)将重组表达载体PET-32a(+)-CASP转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，得到工程菌株；

(3)对大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株进行培养；

(4)纯化重组的CASP融合蛋白，获得CASP基因编码的蛋白质。

所述步骤（1）中重组表达载体PET-32a(+)-CASP的构建包括以下步骤：

a)依据权利要求1所述的CASP基因的两端序列合成一对引物，其中，上游引物P1为5’-ccgGAATTCAAGCCCGTCCAAAAAACCC-3’，含有EcoRI切割位点；下游引物P2为5’-ccgCTCGAGCACGTACGAA CCAATGGC-3’，含有XhoI切割位点；