[发明专利]表达重组人血白蛋白的酵母菌、其构建方法及应用和表达重组人血白蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效表达重组人血白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌，所述巴斯德毕赤酵母菌的构建方法和应用，以及利用所述巴斯德毕赤酵母菌表达重组人血白蛋白的方法。 

背景技术

人血白蛋白（HSA）是人血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的40%～60%，在体内起着维持血浆胶体渗透压、运输营养等重要作用。人血白蛋白临床上主要用于失血创伤、烧伤引起的休克、脑水肿及损伤引起的颅压升高、肝硬化及肾病引起的水肿或腹水；在心肺分流术、烧伤的辅助治疗、血液透析的辅助治疗及成人呼吸窘迫综合征中也有广泛应用，是医院临床急救或重症手术的必备药品，在医院市场一直占据举足轻重的地位。人血白蛋白通常由血浆提取。由于浆站改制及血液制品安全监管力度的加强等诸多因素的影响，国内市场以人血白蛋白为代表的血液制品供应严重短缺，供需矛盾问题突出。采用基因工程方法生产重组人血白蛋白具有原料来源丰富、质量可控、可形成规模化生产等优点，同时可以彻底消除病毒污染危险，对于缓解国内人血白蛋白供不应求的局面、消除血源产品的安全风险具有十分重要的社会意义和经济意义，具有广阔的发展空间和市场前景。 

目前，重组人血白蛋白已经在巴斯德毕赤酵母（日本三菱制药株式会社）的表达系统获得成功表达及生产，相关药物已上市销售（商品名）。巴斯德毕赤酵母表达系统是近十年发展起来的真核表达体系，是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一，与现有的其它表达系统相比，巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分秘、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势，而且培养成本低，产物易分离，现已广泛用于外源蛋白的表达。 

巴斯德毕赤酵母通常是以单倍体形式存在，当环境营养限制时，2个单倍体细胞通过交配融合成二倍体，但是在营养贫瘠时，二倍体倾向于以有性生殖方式进行减数分裂，产生单倍体的子囊孢子。基于目前大部分产品剂量较小， 单倍体巴斯德毕赤酵母已经具有较好的表达效率，可以满足大部分产品的生产需求。而二倍体巴斯德毕赤酵母的构建成本可能比较高、构建过程可能比较复杂，目前对于二倍体巴斯德毕赤酵母菌的研究仅限于遗传学研究，几乎没有采用其进行外源蛋白表达的研究报道。 

现有技术中，通常采用增加插入酵母基因组中目的蛋白表达盒拷贝数的方法提高表达量，如对表达菌株进行多次电击转化或是不断提高表达菌株的抗性筛选浓度（无抗性标记的菌株不适用）等。但此类方法需要耗费大量的时间来对大量的重组子进行鉴定和筛选，同时结果具有不可预测性，操作复杂，成本较高。 

发明内容

本发明的目的是提供一种表达重组人血白蛋白的二倍体巴斯德毕赤酵母菌及其制备方法，所述方法能够低成本、便捷地制备二倍体巴斯德毕赤酵母菌，所述二倍体巴斯德毕赤酵母菌能够高效表达重组人血白蛋白，有效解决现有技术中表达菌株构建周期长、表达量偏低等问题。 

在第一个方面，本发明提供一种二倍体巴斯德毕赤酵母菌，所述二倍体巴斯德毕赤酵母菌含有两个染色体组，两个染色体组均包含人血白蛋白成熟肽编码序列但分别包含不同的筛选标记。 

在第二个方面，本发明提供一种构建表达重组人血白蛋白的二倍体巴斯德毕赤酵母菌的方法，所述方法使用两种均含有人血白蛋白成熟肽编码序列但具有不同筛选标记的单倍体巴斯德毕赤酵母菌，通过将两种单倍体巴斯德毕赤酵母菌进行交配获得二倍体巴斯德毕赤酵母菌。 

在第三个方面，本发明提供本发明的二倍体巴斯德毕赤酵母在表达重组人血白蛋白中的应用。 

在第四个方面，本发明提供一种表达重组人血白蛋白的方法，所述方法包括发酵本发明的二倍体巴斯德毕赤酵母菌。 

利用交配方法进行二倍体巴斯德毕赤酵母菌株的选育，在短期内便可得到拷贝数不低于2的二倍体巴斯德毕赤酵母菌株，这无论是从筛选时间上还是工作量上都要少于上述常规方法。选育的二倍体菌株可以稳定存在并且高效表达重组人血白蛋白，所表达的蛋白结构正确。本发明大幅度的提高了表达效率，与现有的常规生产菌株相比，表达量大幅度提高；且本发明操作简单，成本低 廉，易于实现产业化生产。 

附图说明

图1为实施例1中载体pUC57-Alb结构示意图。 

图2为实施例2中重组表达载体pPIC9K-AlbN结构示意图。 

图3为实施例3中重组表达载体pPIC9-AlbN结构示意图。 

图4为实施例4中重组表达载体pPIC9-AlbA结构示意图。 

图5为实施例5中重组表达载体pPICZα-AlbA结构示意图。