[发明专利]一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆及构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆，还涉及一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆的制备方法，以及该克隆拯救出的Rluc-JEV报告病毒在抗病毒药物筛选、动物活体成像以及乙型脑炎疫苗评价中的应用。

背景技术

日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）是流行性乙型脑炎（简称乙脑）的病原体，病毒通过蚊虫叮咬传播，病毒随着蚊虫唾液进入人体，引发中枢神经系统损伤，病死率和致残率高，作为一种以儿童为高发人群的传染病，乙脑严重危害儿童的身心健康。乙脑主要流行于亚洲地区，1995年开始传播至澳大利亚，近年来流行区覆盖至亚洲和太平洋地区的24个国家，已成为严重的公共卫生问题。我国是乙脑流行最严重的国家之一，乙脑疫苗的大规模使用明显降低了我国乙脑发病率。尽管如此，2012年WHO统计结果显示，全球每年约有20,000例流行性乙脑病例发生，其中60000人死亡，约有30%-50%的患者存有终生神经系统后遗症，我国大陆的发病人数仍占全球病例的50%左右。目前为止，尚无特效抗病毒药物治疗JEV感染引发的乙型脑炎，主要采用对症及支持疗法。为了降低乙型脑炎的病死率和后遗症的发生，科学工作者针对JEV展开了深入研究，包括病毒复制机制和致病机理等，以期为研制针对乙脑的抗病毒药物，研发新型疫苗和改良治疗方法提供理论依据。

JEV病毒属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus）成员，同属的其它病毒包括登革病毒（DENV）、蜱传脑炎病毒（TBEV）、黄热病毒（YFV）和西尼罗河病毒（WN V）等，均是引起人类致病的重要病原体。黄病毒属病毒为包膜病毒，基因组为单正链RN A，大约长10～11kb,5’端具有有细胞mRNA类似的7-甲基鸟苷帽(Cap)结构，但3’端缺少多聚腺苷尾Poly A.病毒基因组含有一个大的阅读框，在进入细胞后即可以自身为信使RN A，翻译出一条多聚蛋白，在细胞和病毒蛋白酶的作用下切割成三个结构蛋白和七个非结构蛋白。非结构蛋白有多种酶活性，主要参与病毒的复制，包括NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5.结构蛋白主要与病毒的包装有关，分别是衣壳蛋白（Capsid,C）、p rM蛋白和包膜E蛋白。

RNA病毒的反向遗传学技术，也称为“病毒拯救”技术，一般是在质粒中构建含有整个病毒基因组的cDNA拷贝，通过体外转录过程再次得到病毒基因组RNA，将此RNA转染病毒敏感细胞中可以拯救出活病毒，这种cDNA质粒称为感染性克隆。通过感染性cDN A克隆，科学工作者可以在DNA水平上对病毒基因组进行各种修饰和改造，通过病毒的表型来判断这些操作对病毒的影响，从而研究病毒复制机制和致病机理，甚至得到减毒株，研发新型疫苗。因此，感染性克隆的构建解决了RNA病毒基因组难以操作的困扰，为RNA病毒的研究提供有效的工具。目前已有许多RNA病毒的全长感染性克隆构建成功，如肠道病毒属的EV71病毒、脊髓灰质炎病毒，黄病毒属的登革病毒、黄热病毒等，在RNA病毒研究领域有广泛的应用。报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因，如荧光蛋白或荧光素酶等。在感染性克隆的基础上，将报告基因与病毒基因组融合，构建含有报告基因的病毒cDNA感染性克隆,拯救出具有感染性的稳定表达报告基因的病毒，通过测定报告基因所表达蛋白的活性即可直观判断病毒生长情况。与传统的病毒滴度检测方法相比，报告基因的表达检测灵敏度更高、检测时间极大缩短，可以大大提高病毒检测的效率和灵敏度。这种含有含有报告基因和病毒基因组的克隆称为报告病毒感染性克隆，其拯救出的病毒称为报告病毒。与感染性克隆相比，报告病毒感染性克隆显然有着更加便捷的优势。

活体动物体内成像是近年来新兴的检测活体动物体内基因表达及细胞活动的光学成像技术，具有操作简便，直观性强的特点。活体动物体内光学成像主要采用生物发光技术和荧光技术。其中生物发光是用荧光素酶基因标记细胞或DNA，利用报告基因产生的生物发光就可以形成体内的生物光源。虽然哺乳动物组织是不透光的，但是利用灵敏的光子成像技术可以从动物体表检测到组织内部的生物光源，使研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为，操作简单、结果直观、灵敏度高，是一种十分有效的研究实验动物生理过程的技术，广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。因此，将荧光素酶与病毒基因组进行融合而构建的报告病毒感染性克隆，是将反向遗传学技术与活体动物成像技术结合起来，对病毒在体内进行追踪，观察病毒在体内的发展过程，可为研究者提供广阔的应用空间。