[发明专利]一种鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的细胞提取和鉴定方法，具体地说，涉及的是一种鲤鱼局部细胞的提取和鉴定方法。

背景技术

鱼类的免疫系统是由非特异性免疫和特异性免疫组成。鱼类的免疫系统亦由免疫组织和器官、免疫细胞和体液免疫因子组成。而免疫细胞有两类：一类是淋巴细胞，主要进行特异性免疫反应；另一类是吞噬细胞，是非特异性免疫的关键成分，在抵御微生物感染方面具有重要作用。非特异性免疫系统在鱼类抵抗病原生物入侵时发挥着更为重要的作用。巨噬细胞是一种白血球，源自单核细胞，主要是以固定或游离细胞的形态对细胞残片和病原体进行吞噬和消化，再激活淋巴球等免疫细胞，使之对病原体做出反应，阻止其扩散和生长。所以巨噬细胞在鱼类免疫过程中占有极其重要的作用。鱼类巨噬细胞可从不同组织中得到，包括血液、免疫器官(如肾脏)和腹膜腔。

  鲤鱼属鲤科(Cyprinidae)，是一种原产亚洲的淡水鱼，在全国各地均有分布，是我国主要的养殖鱼种之一。鲤鱼具有很大的食用和观赏价值，深受我国广大消费者喜爱。所以作为我们生活中很常见的鱼种之一，鲤鱼和人类联系紧密，所以可以通过探索鲤鱼自身受环境影响程度进而来评估环境对人类的影响，而鲤鱼对环境刺激的反应源自于自身免疫系统的应激行为，所以作为鱼体中非特异性免疫的重要组成部分，巨噬细胞的变化可以更直观的体现应激过程，从而评估环境对其的影响程度。所以提取鲤鱼原代巨噬细胞对进行环境激素毒理实验具有十分重要的意义。

所以本发明中提供的这种鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法能够很好的保证离体巨噬细胞的数量和纯度，从而能够保证满足以鲤鱼巨噬细胞为实验对象的环境激素毒理实验及其他实验的需要。

发明内容

  本发明的目的是提供一种鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法，即无菌剪取鲤鱼头肾，剪碎经筛网过滤，直接铺板过夜，洗去未贴壁的细胞，得到鲤鱼原代巨噬细胞。同时，利用多种方法经行镜检鉴定。本发明能保证所提取原代巨噬细胞的成活率和可靠性，为进一步开展鲤鱼巨噬细胞毒理实验打下基础。

  本发明是通过以下技术方案实现的：

  首先配制Hank’s平衡盐工作液及培养基液。

  Hank’s平衡盐工作液组成为：100 ml HBSS（Hank’s平衡盐溶液），1 ml 1%双抗储液，100 μl 10U/ml Heparin（肝素钠）储液。

  铺板法所用最适培养基液组成为：95ml Leibovitz’s L-15培养基、5ml 5%FCS（小牛血清）、1ml 0.01 M Hepes缓冲液（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）、1ml 1% 双抗储液、100μl 10 U/ml Heparin（肝素钠）储液；用1 M NaOH储液调节pH至7.0-7.4之间，然后用0.22 μm滤头过滤分装。

  其步骤如下：

a.细胞的提取：选择规格均匀、体格健壮的平均体重400-600g的鲤鱼预养2周，饲养条件为，水温25 ± 1°C，光照周期为光照:黑暗=14 h:10 h，每天两次喂食丰年虾。解剖鲤鱼，从尾静脉抽血至鱼腮微白，用剪刀从肛门处沿腹中线向前剪至下颌，找到红鲤鱼头肾所在位置，用灭菌解剖器具无菌取头肾并置于Hank’s平衡盐工作液中重悬，用Hank’s平衡盐工作液清洗2-3次至头肾发白，将头肾剪碎成约1 mm × 1 mm 块状，经孔径为100 μm 细胞筛过滤得细胞悬液，用Hank’s平衡盐工作液1000 rpm，5 min离心洗涤细胞2次后弃上清，加入细胞培养液，吹打使细胞重悬。用血小球计数板进行计数，并用细胞培养液稀释，以铺板法培养鲤鱼巨噬细胞的最适培养条件铺板法贴壁培养增殖，最适条件为：细胞悬液稀释到4×10⁷cells/ml浓度，24孔板铺进1×10⁷ cells/孔，26℃条件下贴壁培养24h，用培养基反复洗涤2-3次洗去未贴壁的细胞后得到分离的原代巨噬细胞。（图1）

b.细胞的鉴定：对得到的原代巨噬细胞镜检鉴定，分别用台盼蓝染色法、瑞氏-姬姆萨染色法和非特异酯酶染色法进行鉴定。

本发明的优点是：提取鲤鱼原代巨噬细胞所需时间短，细胞数量多，纯度和成活率高，操作简单可行。鲤鱼原代巨噬细胞成功提取为分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域的深入研究奠定了基础。

附图说明

  图1为细胞铺板数为1×10⁷ cells时巨噬细胞贴壁24h后贴板密度。