[发明专利]一种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用，更为具体的说是涉及一种中国江苏少棘蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2及其编码的多肽Scolotoxin-Ssm2b和该多肽的重组制备技术，以及该毒素在神经生物学研究和杀虫药物开发中的应用。

 

背景技术

蜈蚣（centipede）是节肢动物门Arthropoda唇足纲Chilopoda动物的总称，全世界约有3300种（Edgecombe, G.D., Giribet, G., Ann. Rev. Entomol. 2007. 52, 151-170.）。蜈蚣科Scolopendridae蜈蚣（以下所称蜈蚣皆指此类）为其中最凶猛的捕食者，主要以昆虫和小型无脊椎动物为食，大型蜈蚣也能捕食蟾蜍、蛇、以至蝙蝠和大鼠等脊椎动物。蜈蚣通过向猎物注入毒液，直接杀死或麻痹猎物而捕食之。与蜘蛛、蝎等捕食性节肢动物一样，在长期的进化过程中，蜈蚣毒液系统发展出了一系列结构独特、性能高效且特异的毒素。然而，与对蜘蛛和蝎各近百种抗昆虫毒素的深入研究相比，人们对蜈蚣抗昆虫毒素的研究相当薄弱(E.F.Schwartz等，Pept Sci. 2012. 98(4):385–405.)，迄今仅见一例蜈蚣抗昆虫毒素基因的重组表达(中国专利 CN 103088030A)。

最新的研究揭示，蜈蚣毒液中不仅含有高丰度的新型高分子量毒液蛋白/酶类，也含有分子骨架显著不同于已知毒素的多肽类毒素（E.A.B.Undheim等，Toxicon. 57 (2011) 512–524），包括多种离子通道毒素（Yang等，Mol Cell Proteomics. 2012;11(9):640-50.；Liu等，J Proteome Res. 2012;11(12):6197-212.），因而被学界视作“新型生物活性分子的丰富来源”。从蜈蚣毒腺中分离获得新的高效、特异的昆虫神经毒素基因及其多肽，进而重组表达或通过转基因技术进入相应的受体，在开发新的神经生物学研究试剂和农业与环境害虫的生物防治中，具有广阔的应用前景。

 

发明内容

本发明的目的是提供一种全新的一种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用

，并进一步得到可以应用于神经毒性类制剂，特别是杀虫剂的多肽产物重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b。在这一过程中，我们还同时得到了一种重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2。

本发明通过构建cDNA文库和测序的方法，从中国江苏少棘蜈蚣毒腺中分离获得了新的蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2及其编码的抗昆虫毒肽Scolotoxin-Ssm2.2b。通过密码子优化合成了重组蜈蚣抗昆虫毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2，在大肠杆菌中表达、纯化得到重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b。进而检测验证了该重组蜈蚣抗昆虫毒素的昆虫神经毒性及其在制备神经毒性类制剂与杀虫剂中的应用可能，从而达到了本发明的发明目的。

本发明所选择的蜈蚣属于少棘蜈蚣(S. subspinipes mutilans)，采自江苏省南京市。

本发明包括以下技术方案：

 一种蜈蚣抗昆虫毒素多肽，具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽、或者其保守性变异多肽、或其活性衍生物。

该抗昆虫毒素多肽选自以下组之一：

（a）  由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列组成的多肽；

（b）  将（a）中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、添加或修饰而形成的具有相同功能的由（a）衍生的多肽。 

一种多核苷酸，该多核苷酸包含有选自以下组之一的核苷酸序列：

 （a）编码2中的多肽的多核苷酸；也就是说编码SEQ ID NO1中的氨基酸序列的核苷酸序列，以及编码与SEQ ID NO1所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO1衍生的多肽；

 （b）与多核苷酸（a）互补的多核苷酸。

所述多核苷酸具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。

一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2，具有如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。

 一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因 rScolotoxin-Ssm2.2的表达纯化方法，包括如下步骤：