[发明专利]一种检测雌酚的电化学免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测和分析化学技术领域，涉及一种能检测三种人工合成的具有类似雌性激素作用的化合物，即己烯雌酚、己烷雌酚和双酚A（以下简称雌酚）的检测方法，具体的说是一种基于抗体交叉反应的电化学免疫检测方法。

背景技术

己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)和己烷雌酚(hexestrol，HEX)（结构见式1）属于1,2-二苯乙烯类药物，它们是人工合成的雌激素类物质。二苯乙烯类激素具有促进动物生长、提高饲料转化率和减少脂肪合成等作用，20世纪60年代曾为各国官方批准使用的促生长剂，用于畜牧业生产。但是滥用1, 2-二苯乙烯类药物会导致动物生理系统功能失调，甚至不可逆的病变，并通过食物链最终危害人类健康，长期摄入会干扰人体正常的激素平衡，导致机体代谢紊乱、发育异常肿瘤、女性乳腺癌和子宫内膜异位、胎儿畸形等严重的问题，在我国和欧美等国家都禁止在动物养殖过程中使用。

双酚A（bisphenol A，BPA）（结构见式1）在工业上被用来合成聚碳酸酯（PC）和环氧树脂等材料。60年代以来就被用于制造塑料（奶）瓶、幼儿用的吸口杯、食品和饮料（奶粉）罐内侧涂层。BPA无处不在，从矿泉水瓶、医疗器械到食品包装的内里，都有它的身影。每年，全世界生产2700万吨含有BPA的塑料。BPA能导致内分泌失调，威胁着胎儿和儿童的健康。癌症和新陈代谢紊乱导致的肥胖也被认为与此有关。欧盟认为含双酚A的奶瓶会诱发性早熟，从2011年3月2日起，禁止生产含双酚A的婴儿奶瓶。

式1 三种雌酚的结构式，（a）己烯雌酚（b）己烷雌酚（c）双酚A。

目前用于DES、HEX和BPA残留检测的方法主要有气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等。但是这些分析方法需要大型分析仪器，过程操作繁琐，不能实现现场检测，有必要研究建立更加高效、快速、灵敏的分析测试方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能检测三种人工合成、具有类似雌性激素作用的化合物，即己烯雌酚、己烷雌酚和双酚A的电化学免疫检测方法，所述的方法快速、高效、灵敏度高，具有较低的检出限，且可应用于现场检测食品中雌酚的残留量。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种检测雌酚的电化学免疫检测方法，包括以下步骤：

1）电化学免疫传感器的制备：首先在经过打磨、抛光和清洗的玻碳电极表面沉积金纳米粒子；然后将石墨烯/雌酚/壳聚糖混合液滴涂于纳米金沉积的玻碳电极表面，制得所述的电化学免疫传感器；

2）标准溶液的配制：配制一组包括空白标样在内的含有不同已知浓度的待测雌酚、pH为7.4的磷酸缓冲溶液为标准溶液，且其中含有相同浓度的己烯雌酚抗体；

3）工作曲线的建立：将所述免疫传感器分别浸入雌酚标准溶液中孵育，孵育后用磷酸缓冲溶液冲洗免疫传感器，在K₃[Fe(CN)₆]溶液中进行差分脉冲伏安（DPV）扫描，记录响应电流；空白标样的响应电流为I₀，含有待测雌酚的标样的响应电流为I_x，响应电流的增加值ΔI等于I_x与I₀的差值；将所述ΔI与标准溶液中雌酚的浓度C绘制成ΔI-C工作曲线，采用线性回归法得到ΔI-C线性回归方程；

4）雌酚的测定：将待测样品配制为含有与步骤2）相同浓度的己烯雌酚抗体的磷酸缓冲溶液，按照与步骤3）相同的方法对所述免疫传感器进行孵育和差分脉冲伏安扫描，记录响应电流；根据响应电流的增加值ΔI和ΔI-C线性回归方程，得到雌酚的含量。

所述的雌酚为己烯雌酚、己烷雌酚和双酚A。

所述的方法中，步骤4）优选地采用标准加入法测定。

本发明方法能够实现三种雌酚的共同检测。进行三种雌酚的检测时，所采用的电化学免疫传感修饰有相对应的石墨烯/雌酚/壳聚糖复合物，所采用的抗体均为己烯雌酚抗体。

本发明的方法可用于各种动物源性食品包括猪、牛、羊等常用动物的肉制品、内脏以及乳制品等中含有的雌酚的检测。

本发明所述的方法用于雌酚的检测，其最低检测限分别是己烯雌酚为0.1 ng/mL，己烷雌酚为0.3 ng/mL，双酚A为0.2 ng/mL；线性范围为己烯雌酚为1~2500 ng/mL，己烷雌酚和双酚A为1~3000 ng/mL。