[发明专利]高尔基体蛋白GP73定量测定试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种高尔基体蛋白GP73定量测定试剂盒，包括盒体（1）和盒体上方的盒盖（2），其特征是：所述盒体（1）内设有微孔板（6）和位于盒体（1）底部的支撑板（3），其中微孔板（6）由48或96个微孔（7）组成，支撑板（3）上开有多个孔（4），所述孔（4）内共放置有八个试剂瓶（5），所述八个试剂瓶（5）内分别含有磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂、校准品、质控品、清洗浓缩液、稀释液以及底物溶液，其中磁分离试剂含有高尔基体蛋白GP73单克隆抗体包被的磁颗粒。

2.一种高尔基体蛋白GP73定量测定检测方法，其特征在于所述检测方法包括试剂准备过程和检测步骤，所述试剂准备过程如下：

步骤一、磁分离试剂的制备

一、磁珠缓冲液配制

（1）、称取TRIS 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，然后称取0.96g TWEEN-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后，再倒入上述1L容器中；

（2）、用移液器将 Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中，然后在上述 1L容器中加入 800ml纯化水，充分搅拌；

（3）、调节PH计测量其 PH值，控制 PH在7.95-8.05之间；

（4）、称取BSA 3g倒入上述1L容器中；

（5）、最后1L容器定容至 1000ml，用0.2um滤器过滤；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存；

二、磁分离试剂的制备

（1）、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ulDMSO中，取2mg抗GP73单克隆抗体溶于PH 9.5的0.1mol/L的PB缓冲液中至总体积为1ml；

（2）、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到上述GP73单克隆抗体溶液中，置室温90min；

（3）、然后将抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中，放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5ml；

（4）、取0.5ml磁珠加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；

（5）、每次加入1.5ml PH9.5的0.1mol/L的PB缓冲液，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4小时；

（6）、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液 37℃15分钟；

（7）、每次加入1.5ml PH7.2的0.1mol/L的PB缓冲液清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；

（8）、用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为 0.05％的GP73磁分离试剂；磁珠保存液配方为0.1％ BSA，0.05％吐温-20，0.02％NaN3，20％乙醇，4℃保存；

（9）、将获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1:1的比例混匀，即得磁分离试剂；

步骤二、酶反应物的制备

步骤三、反应增强剂的配制

（1）、称取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中；用移液器将 Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L容器中；

（2）、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解，然后调PH值，控制PH在 7.35-7.45之间；

（3）、称取Mak33 0.9g于上述1L容器中；最后定容至1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤；

步骤四、校准品稀释液的配制

步骤五、校准品和质控品的配制

步骤六、清洗浓缩液的配制

（1）、称取Kcl 4g、NaCl40g、蔗糖10g于1L容器中；

（2）、称取0.225g Tween-20于100ml容器中加15ml水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；

（3）、用移液器将Proclin-300量取0.225ml于盛有15ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；

（4）、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解；

（5）、调PH，控制其范围在7.35-7.45之间；

（6）、最后定容至1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得；

步骤七、底物溶液的配制

所述高尔基体蛋白GP73的检测步骤如下：

（1）、加50μl高尔基体蛋白GP73校准品、质控品、待测标本至对应微孔底部；

（2）、加50μl酶反应物至每一微孔中；

（3）、加50μl反应增强剂至每一微孔中；

（4）、加50μl磁分离试剂至每一微孔中；

（5）、用塑料薄膜覆盖微孔，多管混匀器轻轻振荡微孔板30s后，置37℃水浴30分钟；

（6）、微孔板放至磁分离器上，确保每个微孔都与分离器表面接触，沉淀2分钟；缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的微孔板连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在微孔上的所有液滴；

（7）、清洗浓缩液用纯化水稀释20倍后，加200μl稀释后的清洗液至每一微孔中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s；加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出，且混匀要彻底；

（8）、重复步骤（6）、（7）、（6）一遍；

（9）、加100μl底物溶液至微孔中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测；

（10）、以校准品浓度的Log值为横坐标，RLU的Log值为纵坐标绘制出标准曲线（双对数曲线），以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的GP73的浓度，其中纵坐标为发光强度，横坐标为GP73浓度（单位为ng/ml）。

3.根据权利要求2所述的一种高尔基体蛋白GP73定量测定试剂盒及其检测方法，其特征在于所述底物溶液的制备包括以下步骤：

一、底物溶液A的配制步骤

（1）、称取硼砂5.721g、硼酸2.474g、鲁米诺1.0g和对碘苯酚0.1mg于1L烧杯中；

（2）、用量筒量取400ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调PH，控制其范围在7.95-8.05之间；

（3）、用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至500ml，混匀后即得；

二、底物溶液B的配制

（1）、称取硼砂5.721g、硼酸2.474g、过氧化脲0.1g和PC300 250ul于1L烧杯中；

（2）、用量筒量取400ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调 PH控制其范围在7.95-8.05之间；

（3）、用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至500ml，混匀后即得。