[发明专利]一种蛇足石杉内生真菌及其在制备8α,15α-环氧化石杉碱甲的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，具体涉及一种蛇足石杉内生真菌及其在制备8α，15α-环氧化石杉碱甲的应用，该应用主要是指采用微生物转化的方法制备8α，15α-环氧化石杉碱甲。 

背景技术

石杉碱甲(huperzine A)是来源于石松科石松属植物蛇足石杉(Huperzia serrata)的一个生物碱类化合物。大量科学研究已经表明，石杉碱甲对中枢乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase，ACHE)具有高效、可逆、高选择性的抑制作用，可用于治疗阿尔茨海默症(AD)，同时对重症肌无力、记忆障碍、血管性痴呆具有显著的疗效。因此，石杉碱甲受到了研究人员的广泛关注，研究的热点主要集中于该化合物及其类似物的化学合成、结构修饰、活性评价、构效关系等方面。 

目前，石杉碱甲及其类似物来源主要有三条途径： 

途径一：从蛇足石杉植株中提取。该方法的缺陷在于：①蛇足石杉属于高等蕨类植物，生长缓慢(自然生长周期长达10～15年)，孢子萌发率低，使得野生资源匮乏(Ma XQ，etαl.The Lycopodium alkaloids.Nat.Prod.Rep.，2004，21，752-772.)；②人工栽培技术落后，使得蛇足石杉植株的成活率极低；③蛇足石杉植株体内的石杉碱甲含量相对较低，王峻等学者采集6种石杉科植物分别对其根、茎、叶、孢子囊等部位测定石杉碱甲含量，发现蛇足石杉植株全草的石杉碱甲含量仅为0.0332％，根部最少为0.0045％，孢子囊最多为0.0601％(王峻， 潘胜利.湖南省石杉属植物中石杉碱甲含量的研究[J].中国药学杂志，2005，21，1616-1618.)。 

途径二：通过蛇足石杉近缘植物的组织培养技术获得。该方法的缺陷在于：由于蛇足石杉近缘植物中含有丰富的微生物，使得其组织培养材料的灭菌困难，因此只有极少数获得了初步成功。Wojciech Szypula等研究报道，以伏贴石杉进行组织培养，其幼嫩新梢中石杉碱甲含量为3.33mg/kg，但未见其大田培养成功，也难以大规模获得石杉碱甲。 

途经三：化学合成。如意大利科学家Kozikowski AP等(1989年)进行了石杉碱甲类似物的合成、英国的Lucey C等(2007年)进行了石杉碱甲的全合成，该方法的缺陷在于：①由于石杉碱甲分子结构存在较强的刚性，对其进行结构修饰的难度很大，目前已经报道的修饰也主要集中于其结构中的吡啶酮环和游离氨基，结构修饰的位点较单一；②合成出来的石杉碱甲类似物只有极少数具有明显的治疗效果，可筛选的化合物较少；③所有的化学合成路线均存在反应条件苛刻、目标产物收率低、无法实现工业化生产等技术障碍。 

微生物生物合成及转化是一种新兴的获得天然产物及其类似物的手段，其本质是利用微生物或其产生的酶(系)对外源添加物进行合成与结构修饰的过程，具有操作简便、条件温和、选择性高、立体专一性强等优势，可以完成非活化饱和碳链的氧化、醚键的断裂等化学方法较难进行的反应。 

有关石杉碱甲的微生物转化研究，近年来才刚兴起，但主要集中在通过微生物发酵的手段来获取石杉碱甲及其类似物。如CN101195804B的中国发明专利(发明名称：蛇足石杉内生真菌及其应用，申请号：200610119149.7)中公开的一种蛇足石杉内生真菌，是从蕨类植物蛇足石杉植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为内生枝顶孢霉(Acremonium  endophytium)。该菌株保藏号为CCTCC M206118。该发明通过蛇足石杉内生真菌菌株液体发酵，产生了石杉碱甲类似化合物。又如CN102168017B的中国发明专利(发明名称：一种石杉碱甲高产菌及用其发酵生产石杉碱甲的方法，申请号：201010296985.9)中公开的一种石杉碱甲高产菌，该菌株为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)isolate YLJ-13，保藏号为CCTCC M2010181。该菌株在改良马铃薯液体培养基进行发酵，从发酵液中得到石杉碱甲。上述两个技术方案的不足之处均在于：通过发酵方法获得的目标化合物产率低，无法满足工业化生产的需求。