[发明专利]检测人乳头状瘤病毒13种亚型的荧光PCR试剂盒及其方法

说明书

本发明公开了一种检测人乳头状瘤病毒13种亚型的荧光PCR试剂盒及其方法。所述的试剂盒包括：PCR反应液，PCR混合液，阳性标准品，内参考品和阴性参考品。本发明采用了独特的四重荧光定量PCR技术，分别设计人乳头状瘤病毒的13种亚型的对应的PCR扩增引物和探测探针，分为2管可一次性分型定量检测人乳头状瘤病毒的6种高危亚型，合并分型检测在中国人群中不常见的7种高危亚型。

技术领域

本发明涉及一种检测人乳头状瘤病毒13种亚型的荧光PCR试剂盒及其方法，属于人乳头状瘤病毒亚型的检测领域。本发明涉及应用多重实时荧光定量PCR技术在两个PCR反应管中同时快速地定型定量检测6种高危亚型的人乳头状瘤病毒(HPV-16，18，31，33，52，58)及合并定型检测7种中国人不常见的高危亚型人乳头状瘤病毒(HPV-35，39，45，51，56，59，68)的方法。

背景技术

人乳头状瘤病毒(Human Papilloma Virus,HPV)

是一种双链DNA病毒，属于乳头瘤病毒属，是一种特异性感染皮肤或粘膜复层上皮的病毒。目前，HPV已被发现的亚型有接近两百种，其中大部分感染人类后并没有表现出明显的症状，少数部分有病理表现，有些可能会引起人类疣，如生长在生殖器附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣。一些高危亚型会引起人类的肿瘤，导致宫颈癌、阴道癌、肛门癌、阴茎癌等的发生。其中超过30种HPV亚型的传播是通过性接触而引起生殖区的病变。

HPV感染是宫颈癌的直接病因，从感染到最终宫颈癌的发生对大多数患者而言有一个缓慢的潜伏期。因此，及时定期对宫颈脱落细胞进行HPV的检测在宫颈癌的早期筛查、辅助诊断和愈后评估等环节中显得尤为重要。宫颈癌早期症状不明显，筛查预警对早期发现宫颈癌，降低死亡率极为重要。目前HPV的诊断完全依赖于临床标本中HPV DNA的检测。HPV分型与临床的结合研究已经证实不同的HPV基因型和不同的病毒载量有着不同的致癌性，因而HPV DNA的分型定量检测对宫颈癌及女性生殖道肿瘤的病因学和癌前预报具有重要的意义。

由于HPV至今尚不能在体外培养，又无合适的实验动物，因而对其检测主要依赖于形态学鉴定和分子生物学检测技术。目前HPV检测方法主要有组织细胞病理学检测、斑点印迹法、荧光原位杂交法、Southern杂交法、多聚合酶链反应法(Polymerase ChainReaction，PCR)和杂交捕获法等。细胞学法敏感度和特异度较低，斑点印迹法具有放射性。敏感度较高的方法有原位杂交与传统PCR法，但核酶印迹原位杂交法复杂，传统PCR法特异性很低，假阳性率较高，不宜大规模临床使用。

目前HC-II是一通过食品和药物管理局(FDA)批准的可临床使用的检测HPVDNA的技术，但其不能对HPV进行具体分型，且存在交叉杂交的问题。

多重荧光定量PCR技术不仅可以检测具体型别还可以检测所有型别，是一个有较大发展前景的方法。针对现有方法的缺点和不足，我们通过不断的努力，将各种检测方法有机结合，取长补短，研发出简单、快速、方便、价廉，且敏感性、特异性很高的HPV检测方法并应用于宫颈癌的筛查中。