[发明专利]一种特异性沙门氏菌系列诊断血清工程菌株的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，涉及能够制备特异性沙门氏菌系列诊断血清的工程菌株，更具体说是一种能够制备特异性沙门氏菌H:k诊断血清的工程菌株及构建方法。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，是革兰氏阴性菌。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由沙门氏菌属(Salmonella)中的不同血清型感染各种动物而引起的多种疾病的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。

鞭毛(flagella)是革兰氏阴性细菌表面的一种附属结构，负责细菌的运动。不同种类的细菌以及同一种细菌的不同血清型所含有的鞭毛数量也不同，从几根到数十根，最长可达70 μm，直径一般为10～20 nm。除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外，大多沙门氏菌有周身鞭毛。将有动力的沙门氏菌穿刺接种于半固体培养基，它将沿穿刺线向周围扩散生长。

沙门氏菌具有复杂的抗原结构，一般沙门氏菌具有菌体(O)抗原、鞭毛(H)抗原和表面抗原（荚膜或包膜抗原）三种抗原。鞭毛抗原（H抗原）是沙门氏菌等革兰氏阴性菌表面的主要抗原之一，其血清学水平上的变异在种内分型上有重要意义。沙门氏菌的鞭毛蛋白是由fliC或fljB基因编码的，约1.5 kb。沙门氏菌的H抗原分为第一相和第二相。一相由fliC编码，二相由fljB编码，这两个基因通过相位变异机制协同表达。Kauffmann-White抗原表根据沙门菌菌体抗原和鞭毛抗原的不同将沙门菌描述成许多不同的血清型。目前已确认沙门氏菌有2500个以上的血清型。

沙门氏菌诊断血清是用沙门氏菌属的代表菌株制成灭活菌抗原分别或混合免疫家兔所得的血清，经吸收除去非特异性凝集素后制成，供凝集试验诊断各型沙门氏菌用。研制沙门氏菌诊断血清一直是生物制品领域的热门课题。传统制备诊断血清的方法包括免疫原及免疫血清的制备，吸收与检定及稳定性试验等相关步骤已经非常成熟。但传统方法耗时长，工作量大。且获得的是多克隆血清，其特异性不高，常发生一些交叉反应。所以研究开发新的方法已是迫在眉睫。本发明即是对传统的血清制备体系的改造，不仅能快速制备出特异性强的诊断血清，而且还能实现交叉反应的有效去除和血清制备的标准化和工程化。

发明内容

本发明的目的是构建能够制备特异性沙门氏菌H:k诊断血清的工程菌株；

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种能够制备特异性沙门氏菌H:k诊断血清的工程菌株，其特征在于：它是将含有编码鞭毛抗原k基因的重组质粒pTrc99a-fliC(k)，转入表面鞭毛抗原合成基因缺失的沙门氏菌中得到的能够有效表达鞭毛抗原k的工程菌株。

更具体地说是将fliC基因用质粒pKD3上的氯霉素乙酰转移酶基因替换，将fljB基因用质粒pKD4上的卡那霉素抗性基因替换，通过抗生素初步筛选出缺失菌株，再经过PCR鉴定及测序鉴定，得到相应的缺失菌株G4831△fliC△fljB，然后再将构建的重组质粒pTrc99a-fliC(k)转入其中，筛选得到能够有效表达鞭毛抗原k的工程菌株。

本发明所述的能够制备特异性沙门氏菌H:k诊断血清的工程菌株，其中所述一相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831△fliC，缺失后基因大小为1100bp（氯霉素乙酰转移酶基因），其序列为SEQ ID NO：1。

本发明所述的能够制备特异性沙门氏菌H:k诊断血清的工程菌株，其中所述二相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831△fliC△fljB，缺失后基因大小仍为1500bp（卡那霉素抗性基因），其序列为SEQ ID NO：2。

本发明进一步公开了特异性沙门氏菌系列诊断血清工程菌株的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：

(1)表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株(G4831△fliC△fljB)的构建；

(2)重组质粒pTrc99a-fliC(k)的构建；

(3)含有重组质粒pTrc99a-fliC(k)的克隆菌株的构建。