[发明专利]一种人胎盘胶原的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以正常分娩后获取的健康人胎盘为原料，制备保持天然结构的人胎盘I型、III型、IV型和V型胶原材料的方法，属于生物医用材料的制备领域。

背景技术

天然胶原作为一种特异性的结构蛋白质，其特点和优势已被广泛认识，并进一步成为生物医用材料的重要原料之一。目前在人体中已知至少26种胶原类型，每一种都为胶原的结构作用增加了特定的功能。哺乳动物胎盘，特别是人胎盘中的胶原含量十分丰富，同时含有I型、III型、IV型和V型胶原，因此是一种十分有价值的制备天然医用胶原的原材料。

使用人胎盘为原料制备的各型天然医用胶原，不携带任何已知的人传染性疾病，克服了使用牛、猪等异种动物组织或器官为原料制备胶原可能存在的病毒污染或潜在的人畜共患疾病的风险，因此人胎盘胶原具有更高的安全性。

关于以人胎盘为原料制备具有天然结构的人胎盘I型、III型、IV型和V型胶原的专利和报道相对较少。国内在二十世纪九十年代初进行过短期少量的人胎盘胶原的研究，主要代表成果有：刘秉慈以人胎盘为原料，经胃蛋白酶消化、盐析后获得沉淀A，并进一步酸性盐提取离心后获得沉淀B，将两种沉淀以不同比例混合并加入生长激素和利多卡因后用于填充小型凹陷性皮肤缺损（中国发明专利，公开号：CN1081379）

到目前为止，尚无文献资料以人胎盘为原料制备具有天然结构的人I型、III型、IV型和V型胶原材料的报道。因此，以健康人胎盘组织为主要原料在较短的周期内制备具有稳定性能的天然结构人I型、III型、IV型和V型医用胶原材料，是具有明显意义的。

发明内容

通过对现有技术的综合分析发现现有技术中存在以下不足：

1.人胎盘中含有I型、III型、IV型和V型胶原，但现有技术最多能提取三种类型的胶原，不能同时获得四种类型的胶原材料，对人胎盘组织资源利用不够充分；

2.现有的胶原提取技术周期冗长，需要15天以上，步骤繁琐，从而使提取效率和产率较为低下，工艺中影响产品质量的关键环节难以控制，容易造成产品质量不够稳定，最终影响胶原及胶原基生物医学材料的应用效果和价值。

本发明的目的在于提供一种人胎盘胶原的制备方法，明显缩短提取胶原的周期，得到高质量的人胎盘胶原。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种人胎盘胶原的制备方法，以人胎盘组织为原料，依次进行预处理、酶消化、分级盐析，分别获得保持天然结构的人I型、III型、IV型和V型医用胶原材料中的至少一种。

通过所述预处理步骤对胎盘组织进行清洗、破碎并去除主要杂质；

在所述酶消化步骤中，采用胃蛋白酶在胶原纤维中的端肽与螺旋区之间的特定位点打断肽链，使胶原溶于消化液中从而与其他组织成分相分离。

再通过所述分级盐析，对不同类型的胶原进行分离、提纯，以获得特定类型的胶原。

作为一种可选方式，所述的人胎盘组织是预产妇在分娩前已进行可传播疾病筛选并正常分娩后获取的新鲜的或经低温冷冻保存的胎盘组织，因此没有已知污染胎盘组织的病毒性病原体，从而使所得胶原具有良好的生物安全性，有利于其在组织工程支架、细胞培养载体、病理研究及药品开发等领域等顺利应用。所述胎盘组织可以选自胎盘的任意部分，如羊膜、绒毛膜或完整的胎盘。

作为一种可选方式，所述的预处理步骤具体包括：将胎盘组织充分清洗并切成小块，低温匀浆后离心去除上清液，沉淀用去离子水清洗后再离心，反复清洗离心2-4次至上清液透明；沉淀用pH为7.2-7.4、含有1.0-20.0 mmol/L金属络合剂、0.5-3.0mol/L中性盐的浓度为0.01-1.0mol/L的预处理缓冲液浸泡并缓慢搅拌2-4h，搅拌速度不能过快，以液面稍有转动为宜；离心后所得沉淀再用预处理缓冲液清洗一次并进行离心，取沉淀备用。通过该步骤能够比较彻底的去掉杂质，获得胶原含量较高的混合物，且耗时短，效率高。

所述金属络合剂可以为氨基羧酸盐（如乙二胺四乙酸盐、二乙烯三胺五羧酸盐等）和羟基羧酸盐（如酒石酸钠、葡萄糖酸钠）中的至少一种。采用所述金属络合剂能更好的消除原料中含有的各种金属杂质，同时也去除各种其它活性生物分子。

所述预处理缓冲液可以为三羟甲基氨基甲烷-盐酸、磷酸氢二钠-柠檬酸、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中的一种。采用所述缓冲液一方面维持体系pH值的稳定，同时还能起到清理杂蛋白的作用，其中三羟甲基氨基甲烷-盐酸清理杂蛋白的效果最佳。