[发明专利]分析环境污染物对明亮发光杆菌长期微板毒性的方法

权利要求书

1.一种分析环境污染物对明亮发光杆菌长期微板毒性的方法，其特征在于具体步骤为：

(1)按照短期微板毒性分析法在固体培养基中培养明亮发光杆菌菌落，菌落在22~23℃培养48小时后，保存于4℃冰箱中备用，所述固体培养基的配方按照短期微板毒性分析法进行配制；

(2)从步骤(1)于4℃冰箱中保存备用的明亮发光杆菌菌落中挑取小米粒大小的菌落接种到长期培养基中培养，长期培养基置于振荡培养箱, 振荡转速设为120转每分钟, 温度保持22~23℃，直至明亮发光杆菌生长至对数期，即其相对发光单位大于等于 1.0×10⁵，所得菌液备用；

(3)按照稀释因子设置12个浓度梯度，即

c_n= c₀×Nⁿ，n=0,1,2,……,11;

其中c₀为储备液浓度，c_n为设置的浓度，N为稀释因子，所属稀释因子根据实际测定情况设定；

(4)取96孔微板备用，所述96孔微板上的微孔呈8行×12列的方式排列，将所述96 孔微板周边的36 个微孔均加入 200 微升蒸馏水，在剩余微孔中选取第 2、3、7 及11 列共 24个微孔作为空白对照，剩余36个微孔为待测孔，按步骤(3)所设定的稀释因子在36个待测孔中均匀设置12个浓度梯度, 各浓度做3 个平行, 每个待测孔中环境污染物溶液的体积为100微升；

(5)将步骤(3)培养的菌液与长期培养基按体积比1:4混合，制得混合菌液；

(6)利用多道移液枪向步骤(4)所述的36个待测孔中分别移取步骤(5)制得的混合菌液100微升，使待测孔中试液的总体积均达到200微升，96孔微板准备完毕；

(7)将步骤(6)准备好的96孔微板在21~23℃下培养12小时，并在21~23℃的环境下测定其相对发光单位；

所述长期培养基的组分浓度为短期培养基相应组分浓度的2倍；

所述相对发光单位在酶标仪上测定, 按下列公式计算环境污染物对明亮发光杆菌长期毒性的抑制率：

E=(I₀－I)/I₀×100%    ；

I₀为空白控制样品的发光强度平均值，I为各浓度3个平行样的发光强度平均值，E为不同浓度时抑制发光百分数。