[发明专利]提高三孢布拉氏霉菌生产番茄红素产量的方法

说明书

技术领域

本发明属于发酵法制备不饱和脂肪烃领域，涉及一种提高三孢布拉氏霉菌生产番茄红素产量的方法，特别是通过改进发酵培养基、添加小分子化合物来提高微生物液体发酵生产次级代谢产物的方法。

背景技术

番茄红素(Lycopene)是类胡萝卜素中的一种，属于异戊二烯类化合物，因最早从番茄中分离发现而得名。研究人员通过对番茄红素的化学结构进行解析发现，在其化学结构中含有11个共轭碳-碳双键以及2个非共轭碳-碳双键，是一种非环状的平面多不饱和脂肪烃，结构式如下。

番茄红素经过环化反应后能够生成β-胡萝卜素。但番茄红素较其它类胡萝卜素具有更优越的生理功能。番茄红素除了是一种很好的食用色素外，还具有多种生物学功能，它能够淬灭单线态氧并清除氧自由基，诱导胞间通讯，调控肿瘤细胞。其中最突出的就是它淬灭单线态氧的能力，单线态氧是具有很强活性的氧自由基，因而具有细胞毒性。它通过与分子结合造成细胞膜系统的损伤，会对细胞膜、线粒体等部位造成重大伤害。而番茄红素则能够接受不同电子激发态的能量，进而生成基态氧分子和三重态番茄红素分子，随后三重态番茄红素分子可通过与溶剂发生一系列旋光和振动反应得到再生，并在此过程中将能量散发出去。经测定发现番茄红素的功效是维生素E的100多倍，β-胡萝卜素的2倍，为类胡萝卜素中最有效的抗氧化剂。

三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)中β-胡萝卜素的合成途径是由乙酰CoA开始，经由乙酰乙酰CoA、3-甲基-3,5-二羟基戊酸在酶的作用下生成异戊二烯基焦磷酸，再在CarB、CarRA、CarR和CarA等基因的调控作用下最终合成β-胡萝卜素。由于在这条代谢通路中番茄红素是β-胡萝卜素的合成前体，因此只要在发酵培养过程中添加合适的小分子化合物，如含氮杂环类化合物和叔胺类化合物，其中包括三乙胺、二异丙胺，就能阻遏三孢布拉氏霉菌将番茄红素代谢为β-胡萝卜素，可以达到大量积累番茄红素的效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素的方法。具体方法是以三孢布拉氏霉菌正负菌为发酵菌种，正负菌单独培养48小时后，按ATCC14271(+)和ATCC14272(-)菌体湿重比1：2的比例混合接入改良的发酵培养基中进行发酵培养，24-72小时后向培养基中添加三丙胺，三丙胺在发酵液中的浓度为0.6-3.3克／升，继续培养48-144小时后结束，然后进行菌丝体中番茄红素的提取等后处理工艺。本发明在没有增加额外消耗的情况下，增加了三孢布拉氏霉菌中番茄红素的含量，大幅度提高了番茄红素的产率，其特征是经过两个方面的改进，一是改良了发酵培养基，使番茄红素的产量取得显著提高；二是进一步在发酵培养过程中添加适量的三丙胺作为代谢阻遏剂，取得了更为显著的效果。具体技术路线如下：

菌种来源

产生番茄红素的菌种是三孢布拉氏霉菌，隶属于霜霉目、白锈科，布拉霉菌属，分正(+)、负(-)两种菌株，属于丝状真菌。本发明选用菌株购买于美国模式生物保藏中心(ATCC)，菌株编号为14271(+)和14272(-)，这是本领域技术人员所熟知的，但并不局限于它们。

发酵与提取工艺

(1)平板培养：

将ATCC14271(+)和ATCC14272(-)分别接种到事先配好并灭菌的平板PDA培养基中，在28℃暗培养24小时。其中平板培养基的组分和含量为：土豆浸出液250毫升，0.025克七水硫酸镁，5克葡萄糖，0.25克磷酸二氢钾，3克琼脂粉，115℃灭菌30分钟，趁热倒入平皿，冷却降温后即制得固体PDA培养基。其中，土豆浸出液为自行配制：取50克新鲜的去皮土豆，切成约2厘米×2厘米×2厘米的小块，加适量双蒸水，于电磁炉上煮沸处理30分钟；之后用四层纱布过滤，用双蒸水将滤液定容至250毫升。

(2)种子培养：

取去皮土豆50克，加入适量的去离子水煮沸，保持沸腾30分钟后冷却，用双层纱布滤去土豆，在清液中加入0.025克七水硫酸镁，5克葡萄糖，0.25克磷酸二氢钾，0.05克维生素B1，定容至250毫升，每份50毫升分装250毫升的三角瓶，用锡纸封口，115℃高温灭菌30分钟。

(3)接菌：

在无菌操作台上，将平板培养好的ATCC14271(+)和ATCC14272(-)各挑取一环，分别加入到装有上述步骤(2)中的三角瓶中，正菌接一瓶，负菌接两瓶，用锡纸封口，放于恒温摇床，在28℃，180-200转／分钟的摇床中培养48小时。

(4)发酵培养：