[发明专利]嘌呤核苷磷酸化酶及其制备方法

权利要求书

1.一种突变的假交替单胞菌属的嘌呤核苷磷酸化酶，其特征在于，与野生型的氨基酸序列相比，所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突变为Tyr。

2.如权利要求1所述的嘌呤核苷磷酸化酶，其特征在于，所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶具有以下一种或多种特性：

(a)比酶活≥30U/mg，较佳地为≥45U/mg；

(b)储存在碱性环境中；

(c)失活温度≥60℃；

(d)在0－55℃，保存时间≥3h。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶。

4.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求4所述的载体或基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)细胞。

7.一种权利要求1所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达出权利要求1所述的突变的嘌呤核苷磷酸化酶；

(b)分离所述的突变的嘌呤核苷磷酸化酶。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤(a)之前，所述方法还包括以下步骤：

(1)提供一假交替单胞菌属的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；

(2)将所述多核苷酸序列中对应于野生型假交替单胞菌属的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中的第97位Asp的密码子突变为编码Tyr的密码子，并且任选地，将所述多核苷酸序列中编码氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leu134和Leu145中的一个或多个密码子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA替换为大肠杆菌相对应的偏爱密码子，从而制得编码权利要求1所述的突变的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；

(3)将上一步骤制得的所述多核苷酸序列导入宿主细胞，从而制得权利要求5所述的宿主细胞。

9.一种改造嘌呤核苷磷酸化酶的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)提供一假交替单胞菌属的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；

(2)将所述多核苷酸序列中对应于野生型假交替单胞菌属的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中的第97位Asp的密码子突变为编码Tyr的密码子，从而制得编码突变的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；

(3)表达上一步骤制得的所述多核苷酸序列，从而制得突变的嘌呤核苷磷酸化酶。

10.一种权利要求1所述的突变的嘌呤核苷磷酸化酶的用途，其特征在于，用于催化肌苷进行磷酸解反应；或用作对肌苷进行磷酸解反应的催化剂。