[发明专利]一种NK细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种自然杀伤细胞（Natural Killer,NK）的培养，即利用转基因饲养细胞和细胞因子联合刺激外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC），获得大量高纯度的NK细胞。

背景技术

NK细胞是一群较大的颗粒化的淋巴细胞，其细胞表面表达CD56且缺少CD3的表达，所以，通常用表面标志CD3^‐CD56⁺来界定NK细胞。NK细胞大约可以占到外周血淋巴细胞的5‐15%，同时分布在人体肝脏、比脏、骨髓和淋巴结等部位。

NK细胞是固有免疫系统重要的组成部分，可以通过多种方式对肿瘤细胞或受感染细胞造成杀伤：1、与靶细胞接触后，释放穿孔素和颗粒酶；2、通过自身表达的配体，刺激并活化靶细胞表面的死亡受体；3、通过抗体依赖的细胞毒作用对靶细胞造成杀伤。

由于NK细胞对肿瘤细胞或受感染细胞可以做出快速的免疫反应，所以在机体的免疫监视中发挥重要的作用。有研究表明，NK细胞不足的患者更容易受到严重的系统性病毒感染。外周血中NK细胞活性高的男性患肿瘤的几率要低10%，而在女性中这一数值是4%。并且，NK细胞在肿瘤组织中的侵润提示较好的预后。

由于NK细胞不需要特异性的抗原刺激，即可对肿瘤细胞造成杀伤的特性，使其在临床上获得了广泛的应用，并取得了一定的疗效。但是，无法在体外培养获得足够数量的高纯度NK细胞，成为了进一步提高临床治疗效果的瓶颈。

最初，NK细胞的活化刺激主要依靠高浓度的IL‐2，经两周的培养，仅能获得10倍左右的增殖。随后，研究人员尝试了使用多种因子组合比如IL‐12、IL‐15、IL‐21、CD2抗体等刺激NK细胞，但是获得的NK细胞的数量和纯度都有限。饲养细胞的使用，使NK细胞的培养效率获得很大的提高。比如，用转染CD137L和mIL‐15的K562细胞作为饲养细胞，可以刺激NK细胞获得超过200倍的增殖。寻找更加理想的刺激NK细胞增殖的方法，已成为科研人员的重要目标。

发明内容

本发明的目的是提供一种NK细胞的高效制备方法，即通过联合细胞因子和饲养细胞的刺激作用，提高NK细胞的增殖速度和纯度。

申请人在长期的研究中发现，将NCR3LG1基因转染到饲养细胞中后，可以刺激活化NK细胞，使其快速增殖，而且它与膜表达的mIL‐15对NK细胞的刺激有协同作用。申请人将NCR3LG1和IL‐15同时转染到K562细胞中，作为饲养细胞刺激活化NK细胞，同时添加IL‐2和IL‐21细胞因子，极大的提高了培养NK细胞的效率，从而促成了本发明。

上述NK细胞的高效制备方法，包括如下步骤：

1)使用慢病毒转染系统将NCR3LG1基因核苷酸片段和包含有mIL‐15基因的核苷酸片段同时转染到K562细胞，作为制备NK细胞的饲养细胞；

其中NCR3LG1基因核苷酸片段的序列为：SEQ ID NO:1，包含有mIL‐15基因的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:2；

2）将从外周血分离得到的PBMC用培养液重悬后，接种培养瓶中，同时接种灭活的K562饲养细胞和IL‐2和IL‐21因子进行培养；

3）培养4天后，将细胞转移到透气的细胞培养袋中继续扩大培养；

4）持续扩大培养至第7天，再次添加灭活的K562细胞进行二次刺激；

5）持续扩大培养至第21天，收获细胞，完成NK细胞的制备。

本发明步骤2）所述的培养液，其配方组成如下:氯化钙40mg/ml、氯化钾300mg/ml、硫酸镁120mg/ml、氯化钠5000mg/ml、磷酸二氢钾300mg/ml、碳酸氢钙1200mg/ml、氨基酸1365mg/ml、维生素21.4mg/ml、微量元素0.93126mg/ml、白蛋白450mg/ml、胰岛素8mg/ml、亚油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、双甘氨肽mg/ml、次黄嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.1mg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺嘧啶0.12mg/ml。

其中氨基酸的配比如下：8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份组氨酸、80份异亮氨酸、4份亮氨酸、4份赖氨酸、20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份丝氨酸、8份苏氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份缬氨酸。