[发明专利]一种植物小RNA的快速提取方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种提取方法，具体是一种植物小RNA的快速提取方法。

背景技术

小RNA(non-coding small RNA)是一类长20-30个核苷酸(nucleotide,nt)的内源非编码RNA分子，已在动物，植物，藻类以及真菌等多种真核生物中发现，它可在转录及转录后水平上调控基因的表达。小RNA主要包括小的干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)和微小RNA(microRNAs,miRNAs)，它们可以通过与互补序列结合的方式，关闭或调节目标基因的表达，从而操纵着许多细胞功能。microRNA(miRNA)是继siRNA之后新的研究热点之一。植物miRNA广泛参与植物的生长发育、细胞代谢、器官形态建成、激素分泌、信号转导、胁迫应答等过程，因此小RNA已成为功能研究的热点。

获得高质量的小RNA是后续表达及功能研究的前提，尤其在构建小RNA文库时，高质量的小RNA是成功建库的关键和前提。

目前，许多关于植物RNA提取的方法已较为成熟，但这些方法大部分都不关注长度小于100bp的小RNA的去留，通常采用LiCl进行RNA的选择性沉淀，结果导致大部分的小RNA丢失。

近几年来，人们对miRNA的研究进展十分迅速。在植物界，虽然已经初步鉴定了拟南芥、水稻等主要模式植物中的miRNA，但大多数miRNA功能还不清楚。此外，除拟南芥、水稻等植物外，其它重要经济作物(如香蕉)的miRNA分离和鉴定工作尚未启动，miRNA的研究工作仍处于起步阶段。

香蕉是一种重要的果粮兼备的热带经济作物，其具有独特的胞质遗传特点，即线粒体父系和叶绿体母系遗传，和其在基因组上具有不同的倍性水平，使得香蕉在研究栽培作物进化、在染色体和序列水平上分析亲本基因组的互作杂交和多倍体作用方面成为最具有吸引力的模式植物，要想获得高质量香蕉叶片小RNA，必须能够有效除去多糖、酚类和蛋白质等干扰物质，并能在整个提取过程中抑制RNase的活性。虽然有关小RNA提取的试剂盒也被开发出来，但对于执拗性的植物（如香蕉）往往效果不佳，且昂贵的价格给研究工作带来很大的经济压力，难以被普遍接受。目前，miRBase20.0数据库中尚未收录香蕉miRNA信息，关于香蕉组织特异性miRNA表达情况的研究亦未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种简单、经济、高效的植物小RNA的快速提取方法，为研究人员在实际工作中提供更多的选择。本方法所提取的小RNA质量高，可以满足RT-PCR，miRNA等研究的需要，同时可以大大降低实验的成本。

本发明所采用的技术方案：

一种植物小RNA的快速提取方法，其步骤如下：

1）取植物组织（如植物的叶片、花蕾、果实等）在液氮中迅速研碎后与CTAB提取液混匀，加入量为每毫升CTAB提取液加入0.2g植物组织，65℃水浴10～60分钟；

2）离心，取上清，用2倍上清液体积的水饱和酚/氯仿混合试剂抽提至无中间相；

3）离心，取上清，加入2倍上清液体积的无水乙醇和1／10上清液体积的pH值为5.2、浓度为3mol／L的醋酸钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上；

4）离心，弃上清，沉淀物用300μl浓度为4mol／L的异硫氰酸胍溶液和100μl pH值为4.0、浓度为2mol／L的醋酸钠溶液重悬，加入1倍上清液体积的水饱和酚/氯仿混合试剂抽提至无中间相；

5）离心，取上清，加入2倍上清液体积的无水乙醇和1／10上清液体积的pH值为5.2、浓度为3mol／L的醋酸钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上；

6）离心，弃上清，沉淀物用400μl DEPC水溶解，加入50μl50%PEG8000和50μl5mol／L氯化钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置30分钟以上；

7）离心，取上清，加入2.5倍上清液体积的无水乙醇和1/10上清液体积的pH值为5.2、浓度为3mol／L的醋酸钠溶液，－70℃放置30分钟以上；

8）离心，沉淀物以75%乙醇洗涤2～3次，风干后用DEPC水溶解，备用。

所述水饱和酚与氯仿组成的混合试剂中水饱和酚与氯仿的体积比为1︰1。

所述植物是指富含多糖多酚的植物。

所述的离心条件为：转速8000～13000rpm，时间5～20分钟。