[发明专利]一种嗜热酮还原酶突变体、编码基因及其应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种嗜热酮还原酶突变体、编码基因、重组载体及其应用。

（二）背景技术

生物学上，手性产物的生成可经过化学与酶的催化，不对称还原，多步反应合成。其中，生物催化的不对称还原在理论上说，在温和的条件下可以使产物对映选择性达到99%。然而，在本发明中超嗜热菌海栖热袍菌表达的蛋白Tm酶活反应初始时并不能使产物的单一构型达到理想值，需要在同源建模、分子模拟和化学分子量分析等基础上，对酶进行理性设计，定点突变，以期望能生成有效的生物催化酶。

目前越来越多的药物或其中间体是通过一种生物酶催化合成的方式，而非化学合成。很明显，酶催化相比于传统的化学合成有极大的优势：1，生物反应中可避免有毒的反应试剂或溶剂；2，酶具有高效率、底物特异性等特点，使得在反应中保护抗体的羰基团；3，避免了包括消旋化等在内的副反应。

国内外对于生物催化的研究越来越多，其中一个关键问题是所用的酶往往不能完全满足实际工业化生产的要求，需要经过进一步的改造，以提高其稳定性，活性及手性选择性。通过理性设计点突变的方法构建新酶更是一种常规方法。构建突变体酶改造的方法主要可分为三种类：非理性突变，半理性突变，理性突变。

非理性突变：首先对基因随机突变，体外随机突变的技术多种多样，主要有易错PCR技术（error-prone PCR），DNA重排技术（DNA rearrangement method），基因家族重排技术（gene family rearrangement method）等，获得基因文库后进性筛选出有利的突变体。这种方法工作程序简单明了，可能会出现突变极好的突变体，但也可能不会。突变库容量较大，筛选出有利突变体的比例较低。

半理性突变：组合活性位点测试（CASTing）就是其中的一种。基本要点是：通过同源建模或晶体结构确定酶底物口袋中侧链朝向位点的氨基酸残基，同时选择可以与其相互作用的另一个残基，构建饱和突变体库，以达到减少突变库容量的同时增加筛选出有益突变的概率。其构库依据一般为选定底物口袋范围内的所有氨基酸残基，将侧链朝向底物口袋的选出，根据其所在的位点的二级结构（ɑ螺旋为n+4，β折叠为n+2，loop为n+1）选定另一个氨基酸，针对这两个氨基酸构建饱和突变进行筛选。这种策略构建的突变库库容量小，有效性高。

理性突变：在酶-底物三维建模和底物对接的基础上，加以软件分析，通过化学量子计算、热能计算、分子动力学分析等，在酶活性中心区域选择有效的点进行定向突变，直接获得有益的突变体。这种方法突变库的量极小，筛选出优突变的概率基本上达到100%。然而，前期的计算工作量极大，时间长需要知识的较多前期积累，现阶段还无法达到通过先计算再进行定点定向突变的程序。

很多的文献和专利中都报道了关于酮还原酶催化还原含酮基底物生成羟基化的产物，使反应变得高效率，具有底物特异性或旋光纯选择性等优势。例如，有些研究是从赭色掷孢酵母提取出一种酮还原酶催化对取代乙酰苯（Cl-，Br-，Me-，OMe-，MeC₃，CF₃-等），旋光选择性极低，需要通过理性设计突变位点，定点突变将其氨基酸序列中242位的甲硫氨酸以亮氨酸取代，氨基酸序列中245位的谷氨酰胺以脯氨酸取代，组成有效的双突变体酶。该突变体酶在原条件下催化具有各种取代基的对取代乙酰苯，使生成的产物构型由R-转变为S-，同时使原S-产物的ee值提高至99％。这一成果具有极高的价值。

也有相关研究如：提取于橘青霉的酮脂还原酶（ker），用于催化4-溴-3-氧基丁酸生成高纯度的（S-）4-溴-3-羟基丁酸，酶活稳定性低，一般在30℃热浴6h后酶活降低到初始酶活的15%。为了提高稳定性，易错聚合酶链式反应随机突变，然后对突变体进行高通量的筛选，最终获得热稳定性提高的单突变体，它们分别是在其特定氨基酸序列中54位的亮氨酸被谷氨酰胺取代成的单突变体，氨基酸序列中245位的精氨酸被赖氨酸取代成的单突变体，和氨基酸序列中271位置的天冬酰胺被天冬氨酸取代成的单突变体酶，尤其是氨基酸序列中54位的亮氨酸被谷氨酰胺取代的突变体酶在30℃热浴6h后，活性提高到初始酶活的62%，突变后的效果非常显著。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种产物ee值高的嗜热酮还原酶突变体、编码基因、重组载体及其应用。

本发明采用的技术方案是：