[发明专利]新型超灵敏性ELISA方法的建立

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫学检测方法，尤其地涉及一种新的酶联免疫吸附试验（ELISA）方法。 

背景技术

酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA），是一种基于抗原抗体间特异性反应建立的用于检测样品中抗原或抗体的免疫学检测方法，该方法具有简洁、快速、灵敏等特点。自从Engvall和Perlmann于1971年^[1]发明以来该方法得到了迅猛的发展，已广泛应用于各种抗原抗体的检测。其基本原理是将酶分子共价偶联在抗体或抗抗体分子上，这种偶联不改变抗体的免疫学特性以及酶的催化活性，酶标抗体再与吸附在固相载体上的抗原或抗体特异性结合，加入酶底物溶液后，底物在标记酶的催化下产生颜色反应，根据颜色反应的强弱来判断样品中抗原或抗体的含量。ELISA方法集酶催化反应的灵敏性和抗原抗体间结合的特异性于一体，从而赋予了此方法高灵敏性和高特异性。 

以抗原抗体间特异性结合为基础的免疫学定量检测方法始于1959年由Yalow和Berson^[2]发明的用放射性同位素标记来检测胰岛素的放射免疫试验。此后科学工作者在研究此类方法时发现，虽然该方法具有灵敏度高的优点，但同时存在用于标记的同位素对人身伤害性大，而且需要复杂的检测设备等缺点，因此大大限制了此方法的发展和广泛应用。1971年，Engvall和Perlmann用碱性磷酸酶代替放射性同位素标记抗体定量检测了血清中的免疫球蛋白，成功地建立了酶联免疫吸附试验，自此免疫血清学试验进入了酶标记时代。酶标记法较之前有明显的优点，首先该标记为共价标记，具有较好的稳定性，可保持数月至数年有效。其次，酶催化反应为显色反应，读数时仅需要廉价简单的光学仪器。再次，酶催化反应具有高效性，所以保证了ELISA方法的高度灵敏性，这也是该方法一个显著的特点。用于标记的酶应 该具备下特性：在不破坏抗原抗体结合的温度和pH条件下具有高度的酶活性；能够以简易敏感的方法检出；能够被大量地高度纯化，且保持可溶性和稳定性；应具有能够与抗原抗体共价结合的活性基团，并且结合后不影响其催化活性以及抗原抗体的结合活性；反应产物易于显现^[3]。目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、脲酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最为广泛。HRP最常用的可溶性显色底物为联苯二胺（OPD）和四甲基联苯胺（TMB），其中,TMB是一种优于OPD的新型HRP色原底物。在HRP和H₂O₂的存在下，OPD氧化而聚合成2,2’—二氨基偶氮苯，pH=1.0时，最大吸收波长492nm；TMB氧化产生联苯醌，最大吸收波长450nm。