[发明专利]枣疯病植原体环介导等温扩增快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说本发明涉及一种利用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术检测枣疯病植原体的技术领域。

背景技术

枣疯病(Juiube witches’broom,JWB)又称“枣癌症”是由植原体病原侵染导致的、在枣树生产中危害最严重的毁灭性病害。植原体原称类菌原体，为单细胞原核生物，无细胞壁，由生物膜包围，可引起多种病害。根据植原体16S rDNA基因序列为对象进行分析，可将植原体分为28个组。其中引起枣疯病的枣疯病植原体与榆树黄化植原体、葡萄金黄化植原体等同为榆树黄化组成员。枣疯病分布范围广，传播速度快，致病力强，树体一旦感病，终身携带，传统的病害防治技术和栽培技术难以治愈。我国多数枣树主栽品种对枣疯病敏感，全国每年因枣疯病死树高达千万株，直接经济损失高达数亿元，严重阻碍了枣树产业的发展。要从根本上解决枣疯病的防治问题是采取有效的预防措施，加强种苗(接穗、砧木)的检疫检验，采用健康苗木(砧木、接穗)，建立无病苗木繁育体系，从源头上杜绝病原才是控制枣疯病发生蔓延的根本途径，而建立和应用先进的病原检测技术是红枣无病苗木生产的核心所在。

植原体自发现后，其检测技术的发展一直没有大的突破。传统的电镜观察、血清学等检测方法因为灵敏度低、周期长和操作繁琐等不足，已不能满足现代生产的需要。随着分子生物学技术引入植原体病害研究领域，植原体鉴定和检测技术才得到了较快的发展，如普通PCR、巢氏PCR、实时荧光PCR等，但这些方法不仅需要PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪等昂贵的仪器设备，且操作程序繁琐复杂、时间长，对检测人员有较高的技术要求，大大限制了作为快速诊断方法的使用和推广。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等在2000年开发的一种恒温核酸扩增方法，具有特异性强、操作简单、不需要复杂的仪器，肉眼可直接观察检测结果，其高效性、简易性、成本低廉且检测周期短等特点非常适合于基层及现场使用。该技术针对目的基因的6个区段，设计4条特异引物并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在一定温度下对核酸进行等温扩增，近年来，国内外已将该技术广泛应用于病原体的检测。此前，已有应用在肺炎链球菌、西尼罗病毒、SARS病毒、番茄黄叶病毒、山药嵌纹病毒、肺炎支原体等病原微生物的检测以及登革病毒的分型等方面的报道，目前，尚未见利用环介导等温扩增方法检测枣疯病植原体的报道。

发明内容

目前针对现有技术中未见专门利用环介导等温扩增技术检测枣疯病植原体的技术现状，本发明旨在提供一种枣疯病植原体的环介导等温扩增检测方法，能够进行快速、特异、灵敏、简便的现场检测，克服已有技术的不足。

本发明通过以下技术方案实现的：本发明根据枣疯病植原体分离物16S rDNA基因的保守序列，设计了枣疯病植原体LAMP特异性引物，确定反应条件和试剂浓度并进行优化，建立了枣疯病植原体的LAMP快速检测体系，此方法对枣疯病植原体的检测特异性强，1h即可获得检测结果，具有快速、高效、简易的特点。

本发明提供了一种建立枣疯病植原体的环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤。

(1)提供一套用于检测枣疯病植原体的LAMP反应特异性引物序列，具体的寡聚核苷酸序列为：

F3：5′-GTCTGCAACTCGACTTCATGAA-3′

B3：5′-TAACCCCAATCATCAACCCTA-3′

FIP：5′-GGTGTGTACAAACCCCGAGAACGTTTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATC-3′

BIP：5′-AAACCACGAAAGTTAGCAATACCCGTTTTCCTTAGACAGCTCCCTCTTCTTGC-3′。

(2)提供枣疯病植原体的LAMP检测方法，即首先从待检测样品中制备反应模板，并配制LAMP反应体系，然后通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增。

(3)最后通过日光下肉眼观察或电泳检测待测样品中是否含有枣疯病植原体。

具体的，本发明提供了一种枣疯病植原体的环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤：