[发明专利]艾纳香内根-贝壳杉烯合酶基因Bb-KS、其编码蛋白质以及基因克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因及其克隆方法，同时也涉及到基因编码蛋白质，属于生物技术领域，具体涉及一种艾纳香内根-贝壳杉烯合酶基因Bb-KS、其编码蛋白质以及基因克隆方法。 

背景技术

艾纳香(Blumea balsamifera L.DC.)为菊科艾纳香属多年生木质草本植物，主要分布于我国海南、贵州、广西、广东、云南、台湾等省。以其全草或地上部分入药，具有镇痛、发汗、祛风除湿、去痰止咳、通经止血等功效，在黎族、苗族、壮族等少数民族地区有着悠久的用药历史，是一种重要的民间药物。同时艾纳香也是获取天然冰片（艾片）的重要植物来源之一。并且，在精制艾片过程中所产生的艾油具有扩张血管、降低血压、抑制交感神经的作用，因而被广泛应用于医药行业。另外，艾油因其独特的芳香气味，还被广泛应用于香料以及化妆品行业。虽然以艾纳香为原材料的产品众多，然而关于其化学成分的研究较少。 

对于艾纳香而言，其化学成分比较复杂，但具有药理作用的主要集中在黄酮类和挥发油成分上。邓芹英等（1996），曹家庆等（2008），陈铭等（2009）分别对艾纳香中黄酮类成分进行了分析，主要含有艾纳香素、木犀草素、槲皮素、儿茶素以及阿亚黄素等。关于艾纳香挥发油成分的研究：周欣等（2001）、马芝玉等（2009）采用GC/MS方法检测到艾纳香中挥发油成分主要为：L-龙脑、樟脑、β-石竹烯、芳樟醇、大叶香烯D、香木兰烯、顺-α-没药烯、β-荜澄茄油烯、γ-依兰 油烯、ent-贝壳杉烯等萜类化合物。除此之外，艾纳香中还含有多其他种化合物，如小麦黄素、芹菜素、原儿茶酸（甲酯）、咖啡酸（甲酯）、香草酸等化合物。其中，ent-贝壳杉烯类二萜化合物具有广泛的生理活性，主要表现为抗肿瘤活性。由于ent-贝壳杉烯类化合物主要来自于天然产物，化合物供应量非常有限。 

内根-贝壳杉烯合酶（KS）是贝壳杉烯类化合物合成过程中的关键酶之一，也是合成赤霉素等信号分子的关键酶，对植物的生长发育起着至关重要的作用。目前在研究植物生长发育及抗性中涉及较多研究，而从植物次生代谢及产物药理药效活性方面研究较少。KS过去被称为内根-贝壳杉烯合酶B，位于前质体，具有引导序列，与古巴焦磷酸合酶（Copalyl pyrophosphate synthase,CPS）共同催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）形成内根-贝壳杉烯（ent-kaurene）。KS最早是从南瓜未成熟的种子中得到的，其突变严重影响植株的发育。拟南芥中的GA2蛋白编码KS基因，在拟南芥的研究中发现，ga2矮化突变体是由KS基因的功能缺失造成的，对突变体ga2-1的序列进行分析，发现其cDNA中单碱基发生突变导致终止密码子提前出现，从而使得KS基因失活。目前，KS基因在拟南芥、蓖麻、甜叶菊、梨、苹果等植物上成功克隆，但目前还没有关于艾纳香内根-贝壳杉烯合酶（KS）基因的相关报道。因此，对艾纳香内根-贝壳杉烯合酶基因的克隆以及对他们的生物学功能研究，将有助于明确艾纳香中二萜类次生代谢的分子机理，为调控其艾纳香中有效成分等奠定基础。 

发明内容

鉴于上述问题，本发明的主要目的在于提供一种首次从艾纳香种获得的内根-贝壳杉烯合酶基因。 

本发明的另一个目的是提供艾纳香内根-贝壳杉烯合酶编码的氨基酸序列及编码蛋白质性质生物信息学预测。 

同时，本发明还提供该艾纳香内根-贝壳杉烯合酶基因的克隆方法。 

为了达到上述目的，本发明提供： 

本发明所提供的艾纳香内根-贝壳杉烯合酶基因，从艾纳香（Blumea balsamifera DC）中克隆，命名为Bb-KS基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1。 

上述艾纳香内根-贝壳杉烯合酶基因编码的蛋白质，命名为Bb-KS蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2。 

一种艾纳香内根-贝壳杉烯合酶基因Bb-KS的克隆方法，包括如下步骤： 

（1）选用艾纳香叶片作为试验材料，采用TRNzol法提取总RNA； 

（2）采用TaKaRa公司生产的PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录获得cDNA; 

（3）根据NCBI上其他植物KS基因保守区域，设计兼并引物PF1：TGGTCR(A/G)TTTGATCR(A/G)TATK(T/G)CAATC和