[发明专利]CBF1基因在提高绿色木霉的高温耐受性中的应用

权利要求书

1.CBF1基因在提高绿色木霉（Trichoderma viride）的高温耐受性中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述CBF1基因序列如SEQ ID No.1所示。

3.一种转CBF1基因绿色木霉工程菌的构建方法，所述方法包括：

（1）将序列如SEQ ID No.1所示的CBF1基因与载体pENTR混合，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化子经测序确认序列正确后，得到pENTR-CBF1；

（2）将pENTR-CBF1与载体ImpGWB502通过LR重组反应将CBF1基因转移，经过测序确认后，得到表达载体ImpGWB502-CBF1；

（3）将表达载体ImpGWB502-CBF1转入农杆菌，经PCR鉴定，获得带有目的质粒ImpGWB502-CBF1的农杆菌；

（4）将带有目的质粒ImpGWB502-CBF1的农杆菌接种于含100μg/mL壮观霉素+50μg/mL利福平的LB固体培养基，28℃培养2～3天后，挑取单菌落接于含100μg/mL壮观霉素+50μg/mL利福平的LB液体培养基中，28℃、200r/min培养至菌体OD₆₀₀为1.0时，用MM液体培养基将菌液稀释OD₆₀₀至0.15，再加入200μmol/mL的乙酰丁香酮，于28℃、200r/min诱导培养5～6h，至OD₆₀₀为0.5～0.6，得到农杆菌菌液；

（5）步骤（4）所得农杆菌菌液与等体积的浓度为1×10⁶～1×10⁷个/mL的绿色木霉孢子混悬液混合后，涂布于含200μmol/mL乙酰丁香酮的MM固体培养基上，24℃共培养48h，筛选阳性克隆并经PCR鉴定，获得所述转CBF1基因绿色木霉工程菌；

所述MM液体培养基组成如下：10mM葡萄糖，0.5%甘油，200μM乙酰丁香酮，2.5mM NaCl，2mM MgSO₄，0.45mM CaCl₂，9mM FeSO₄，4mM(NH₄)₂SO₄，溶剂为pH5.3的磷酸缓冲液；所述MM固体培养基组成如下：15g/L琼脂，10mM葡萄糖，0.5%甘油，200μM乙酰丁香酮，2.5mM NaCl，2mM MgSO₄，0.45mM CaCl₂，9mM FeSO₄，4mM(NH₄)₂SO₄，溶剂为pH5.3的磷酸缓冲液。