[发明专利]一种基于高尔基银染法的快速神经元染色方法

说明书

技术领域

本发明属于神经病理学组织染色法技术领域，具体涉及基于高尔基银染法的快速神经组织染色的方法。

背景技术

已有的科学研究表明，大脑神经系统有一类专门负责传递和处理神经信号的兴奋性细胞---有棘神经元，主要是由于神经元树突上分布的形态各异的小突起---树突棘而得名。神经元的树突树的精细构筑调控了神经元之间复杂的突触连接，并依此来调节神经信号的传递。树突棘是神经元上突触输入的重要靶点，它与突触可塑性有直接的相关性。因此观察有棘神经元的树突结构的改变对解释大脑复杂的功能基础和神经疾病的病变机理提供了直接证据。

在组织学染色领域，高尔基银染法是目前应用最为广泛的一种观察神经元形态的染色方法，可以用来分析神经元的树突结构和树突棘形态。因其操作方便，耗费小，染色效果好，对显微镜要求低，并且该方法的组织切片在200微米左右可以清晰的显示整个神经元树突的形态。它的传统操作流程是在染色液配置好后，将一定大小的脑组织放置其中，室温避光保存，两天后需要换置新鲜的染色液，14天后取出脑组织进行切片、显影和观察。但是该方法目前还存在一系列问题，比如整个过程费时、切片容易成碎片、染色时容易掉片等等。特别是由于浸染时间需要14天，大大影响了实验进程。目前有很多研究组对该染色方法进行了一些改进来避免上述问题，比如替换显影液，氧化剂等，但是实验时间最短也要5天，也有相关报道将浸染温度改为37℃，但是因为浸染时间的问题，染色效果不如原始方法的好。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于高尔基银染法的快速神经元染色方法，以实现快速观察在体神经元结构，从而能够为临床病例分析神经系统的病变以及神经学的基础研究提供便捷的手段。

本发明基于高尔基银染法的快速神经元染色方法，其特征在于包括以下步骤：

先以质量体积比浓度为5%重铬酸钾、5%氯化汞和5%铬酸钾的水溶液按照体积比1:1:1的比例配制成高尔基银染溶液；

将待神经元染色的脑组织浸没在上述配制的银染溶液中，在37±2℃环境温度下浸泡36到48小时；

然后利用振动切片机将浸泡好的脑组织进行切片，并置于明胶包被的载玻片上，用保鲜膜包裹整个载玻片，放置过夜；

将上述放置过夜的切片经过氨水显影，梯度酒精脱水，二甲苯透明，最后用中性树胶封片。

所述将浸泡好的脑组织进行切片的步骤为：取出浸泡好的脑组织，用磷酸缓冲液冲洗，然后将振动切片机的有关参数设定为：振幅0.45毫米，切片前进速度0.55毫米/秒，切片厚度为200微米，采用振动切片机进行切片。

由于本发明采用了在将组织浸泡的温度从传统高尔基染法采用的室温提高至37±2℃的同时将浸泡时间控制在36到48小时之间，从而在保证染色效果与传统效果类似的基础之上，有效地克服了传统高尔基染色耗时14天的长时程操作、大大精简了传统实验步骤，不需要不断更新浸泡液，同时由于浸泡时间短和振动切片机合理使用，有效克服了传统切片操作难、易碎片的缺点。本发明方法为神经元形态观察提供了一种快速有效的新途径，为神经领域的临床分析和科学研究提供了一种有效的检测手段。

附图说明

图1到图6为采用本发明基于高尔基银染法在不同浸染时间分别处理24小时、36小时、48小时、3天、6天和9天后的锥体神经元的示意图。

图7、图8和图9为本实施例中分别对不同脑组织采用本发明基于高尔基银染法在浸染时间为48小时的神经元示意图。

具体实施方式

实施例1：

下面结合附图通过实施例对本发明作进一步具体详细的说明。

本发明基于高尔基银染法的快速神经元染色方法，具体实施操作步骤包括：

1）配制银染溶液：将质量体积比浓度为5%重铬酸钾（国药）、5%氯化汞（国药）和5%铬酸钾（国药）水溶液按1:1:1的体积比例配制混合好，避光放置。

2）准备样本：大鼠（SD）经过二氧化碳麻醉后，利用蠕动泵进行心脏灌流，灌流液为生理盐水，然后快速断头取脑，将半脑浸没在已配好的银染染色液中。

3）组织样本浸染：按照1:5的体积比将脑组织侵入银染溶液中，避光放置。在37±2℃环境温度下浸泡36到48小时。