[发明专利]检测口蹄疫病毒通用型的RT-PCR引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于动物病毒分子生物检测技术领域，具体涉及一对检测口蹄疫病毒通用型的RT-PCR引物及试剂盒。 

背景技术

口蹄疫（Foot and mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒引起的一种急性高度接触性传染病，主要侵害偶蹄动物，如牛、猪、羊等。其特征是发热、皮肤或粘膜发生水泡溃疡，尤其是在口腔和蹄叉部位。 

口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus,FMDV）属于小RNA病毒科，约有8500个核苷酸组成。病毒基因组由一个开放性阅读框（ORF）、一个5′端非编码区（NCR）和3′端非编码区（NCR）组成，ORF编码由4种结构蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4）、RNA聚合酶（3D）、蛋白酶（L、2A、3C）以及其他非结构蛋白（如3A等）组成。口蹄疫病毒包括7个血清型和60余个亚型，7个血清型为：A型、亚洲I型、O型、C型、南非Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，各型之间无交叉保护反应，同一血清不同分离株之间也存在广泛的抗原变异；由于亚型分类越来越复杂，现在由用于分析基因组遗传衍化关系的基因型代替。 

口蹄疫在亚洲主要流行有A、O型、C型、亚洲I型4个血清型，截至目前，我国仅见O型、A型、亚洲I型三个血清型的口蹄疫。A型在1960—1975年曾流行20多省。目前，A型口蹄疫病毒在我国已广为扩散，是仅次于O型口蹄疫的世界主要流行毒株。广西地处我国沿海地区西南部，东部毗邻广东，西南与越南为界，是我国边疆省区之一。而越南口蹄疫疫情复杂，O型、亚洲I型、A型时有发生。2013年2月，农业部确认广东省茂名市某猪场发生生猪A型口蹄疫疫情。因此建立有效的诊断方法对边境口蹄疫疫情的防控与监测具有重要意义。 

O型、亚洲I型、A型口蹄疫病毒与其他血清型的口蹄疫病毒在致病性上并无明显差异，症状基本相同，主要引起口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱和溃烂。由于口蹄疫传播速度快、感染率高、对畜牧业生产危害严重。目前对于各型口蹄疫病毒的实验室检查主要包括：间接夹心联免疫吸附试验、反向间接血凝试验、中和试验、液相阻断酶联免疫吸附试验、非结构蛋白ELISA检测、正向间接血凝试验等。这些方法的目的是检测相应的抗体，属于血清 学检测方法，鉴于口蹄疫病毒的高度变异性以及交叉性，其特异性难以保证，容易出现假阳性和假阴性，因此建立有效的诊断方法对防治口蹄疫具有重要意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一对检测口蹄疫O型、A型、亚I型病毒通用型的RT-PCR引物及试剂盒，具有较高的灵敏度和特异性，且检测成本低，有良好的应用前景。 

本发明的技术方案为： 

一对检测口蹄疫病毒通用型的RT-PCR引物，所述引物的上游引物核苷酸序列为5′-CTGGGCCCTTCTTCTTC-3′，下游引物核苷酸序列为5′-GCTGTTTCTCTGCTCTCTC-3′。 

一种检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒,所述试剂盒包括以上所述的引物。 

以上所述检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒,所述试剂盒还包括：RNA提取试剂、RT反应试剂、PCR反应试剂、阴性对照和阳性对照。 

所述RNA提取试剂包括：Trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75%的DEPC乙醇； 

所述RT反应试剂包括：5×buffer缓冲液、dNTPs、HIR和下游引物Wd； 

所述PCR反应试剂包括：Taq DNA酶、10×buffer缓冲液、dNTPs、MgCl₂和cDNA； 

所述阴性对照包括：DEPC水； 

所述阳性对照包括：口蹄疫O型全病毒、口蹄疫A型全病毒和口蹄疫亚I型全病毒。 

所述口蹄疫O型全病毒可为中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫O型全病毒，所述口蹄疫A型全病毒可为中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫A型全病毒，所述口蹄疫亚I型全病毒可为中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫亚I型全病毒。 

本发明的具体原理是利用口蹄疫O型、A型、亚I型病毒的同源性，应用OLIG6.0软件，合成一对靶核苷酸序列的特异性引物，用RT-PCR方法扩增出特异性的目的带。试验方法及过程如下： 

1.引物设计：