[发明专利]检测H1N1猪流感病毒的RT-PCR引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于动物病毒分子生物检测技术领域，具体涉及检测H1N1猪流感病毒的RT-PCR引物及试剂盒。 

背景技术

H1Nl亚型猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)是猪流感(Swine influenza，SI)的重要病原之一，为正粘病毒科、A型流感病毒属，由8个分节段的基因组构成，共编码10-11种蛋白。HINl亚型猪流感1918年美国最先报道，Shope于1930年第一次分离鉴定该亚型病毒，这也是首次确诊猪流感病毒，此后不断传播，现已在五大洲都发现其踪迹。该病毒可感染猪，引起猪发生急性、热性呼吸器官传染病，主要以突发的呼吸系统并转归迅速的综合症状为特征，是猪呼吸道综合征症候群疾病之一。由于猪流感病毒对呼吸道上皮细胞具有亲嗜特性，可对其造成损伤，在临床上猪群的发病率可高达100％，病死率1％～4％，如伴随其他呼吸系统疾病的继发、混合感染，会导致猪群的损伤程度和病死率会大幅度增高。目前，从猪体中分离到流感病毒有H1N1、H1N2、H3N2、H1N7、H4N6、H3N6、H5N1和H9N2等多个亚型的病毒，能引起猪流感症状并在当今猪群中传播主要有3个亚型，H1N1、H3N2和H1N2，而H1N1在猪流感病毒中占优势地位，近些年世界各地分离到的猪流感病毒亚型大部分都是H1Nl。Sreta等研究发现H1N1致病力较其它猪流感病毒更强，感染断奶乳猪仔猪的肺损伤度比H3N2的严重，极大危害猪群的健康。值得注意的是，已有报道美国于2005年12月至2009年2月出现的10例H1N1亚型和1例是H1N2猪流感病毒感染人病例，其中证实9例与猪有直接接触史，2009年3月始发于墨西哥的21世纪甲型H1N1流感大流行，令此亚型流感病毒愈加受到高度的重视。 

H1N1猪流感根据病毒基因片段来源不同，可分为古典型H1N1猪流感、类禽型H1Nl猪流感和类人型H1Nl猪流感。三类H1N1猪流感病毒在世界各地处于不同阶段的流行情况各不相同。因此建立有效的诊断方法对防治H1Nl亚型猪流感具有重要意义。 

发明内容

本发明的目的是提供检测H1N1猪流感病毒的RT-PCR引物及试剂盒，具有较高的灵敏度和特异性，且检测成本低，有良好的应用前景。 

本发明的技术方案为： 

检测H1N1猪流感病毒的RT-PCR引物，所述引物为两对：针对H1基因的引物和针对N1 基因的引物，所述针对H1基因引物的上游引物ɑHu核苷酸序列为5’-GGAATGGTAGATGGATGGT-3’，下游引物Hd核苷酸序列为5’-ACCCATTAGAACACATCCAGAA-3’，针对N1基因引物的上游引物Nu核苷酸序列为5’-TCCAAGGGGGATGTGTTTG-3’，下游引物Nd核苷酸序列为5’-GACCAAGCGACTGACTCAA-3’。 

一种检测H1N1猪流感病毒的试剂盒,所述试剂盒包括以上所述的引物。 

以上所述检测H1N1猪流感病毒的试剂盒,所述试剂盒还包括：RNA提取试剂、RT反应试剂、PCR反应试剂、阴性对照和阳性对照。 

所述RNA提取试剂包括：Trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75%的DEPC乙醇； 

所述RT反应试剂包括：5×buffer缓冲液、dNTPs、HIR、Uni12； 

所述PCR反应试剂包括：Taq DNA酶、10×buffer缓冲液、dNTPs、MgCl₂和cDNA； 

所述阴性对照包括：DEPC水； 

所述阳性对照包括：古典型H1N1猪流感病毒、类禽型H1Nl猪流感病毒和类人型H1Nl猪流感病毒。 

所述古典型H1N1猪流感病毒可为古典型H1N1猪流感毒株，如：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心实验室分离保存的古典型H1N1猪流感毒株；所述类禽型H1Nl猪流感病毒可为类禽型H1Nl猪流感毒株，如：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心实验室分离保存的类禽型H1Nl猪流感毒株；所述类人型H1Nl猪流感病毒可为类人型H1Nl猪流感毒株，如：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心实验室分离保存的类人型H1Nl猪流感毒株。 

本发明的具体原理是利用H1N1猪流感病毒的同源性，应用OLIG6.0软件，合成针对H1基因和N1基因的两对靶核苷酸序列的特异性引物，用RT-PCR方法扩增出特异性的目的带。试验方法及过程如下： 

1.引物设计：