[发明专利]检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的RT-PCR引物及试剂盒

权利要求书

1.一对检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的RT-PCR引物，其特征在于，所述引物的上游引物核苷酸序列为5′-ATGTGGGATAGGGTGGACA-3′，下游引物核苷酸序列为5′-AAGAACCAGAAAAGACACCCAA-3′。

2.一种检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的试剂盒, 其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的试剂盒, 其特征在于，所述试剂盒还包括：RNA提取试剂、RT反应试剂、PCR反应试剂、电泳检测试剂、阴性对照和阳性对照。

4.根据权利要求3所述检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的试剂盒, 其特征在于：

（1）所述RNA提取试剂包括：Trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75%的DEPC乙醇；

（2）所述RT反应试剂包括：5×buffer缓冲液、dNTPs、HIR和下游引物E-Sd；

（3）所述PCR反应试剂包括：Taq DNA酶、10×buffer缓冲液、dNTPs、MgCl₂和cDNA；

（4）所述电泳检测试剂包括：50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液；

（5）所述阴性对照包括：DEPC水；

（6）所述阳性对照包括：猪蓝耳病病毒欧洲型、猪蓝耳病病毒美洲型。

5.根据权利要求4所述检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的试剂盒，其特征在于，所述猪蓝耳病病毒欧洲型为猪蓝耳病病毒欧洲型LV株；所述猪蓝耳病病毒美洲型为高致病性猪蓝耳病病毒JXA1-R株。

6.一种如权利要求4-5中任一所述检测口蹄疫A型病毒试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

（1）病毒RNA的提取：  

取待检样品、阳性对照、阴性对照各500μL于1.5ml灭菌无RNA酶污染的EP管中，加入等量Trizol裂解液进行裂解，充分振荡，室温放置10分钟；加入300μL氯仿，摇匀放置10分钟；低温高速离心机12000转/分钟离心15分钟；缓慢取出上层液体600μL放置于新的EP管；加入等量异丙醇轻轻混匀，-20℃放置30分钟；低温高速离心机12000转/分钟离心15分钟，弃去上清液；用75%的DEPC乙醇吸取1ml于管内洗涤沉淀，充分吸弃洗涤；将EP管倒置于吸水纸上，尽量吸干液体，放置于37℃温箱中15分钟，管内无可见水珠时取出；加入25μL DEPC水，-20℃保存备用；

（2）RT操作程序：  

取5×buffer缓冲液5μL、dNTPs 2μL、M-MLV 0.5μL、HIR 0.5μL、下游引物E-Sd 2μL，RNA 15μL， 将上述液体置于同一EP管内，混匀后放于PCR仪按如下程序操作：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min；

（3）PCR操作程序：

上游引物E-Su 0.5μL、下游引物E-Sd 0.5μL、Taq DNA酶0.2μL、10×buffer缓冲液2.5μL、dNTPs 2μL、MgCl₂2μL、DEPC水12.3μL, cDNA 5μL，将上述液体置于同一EP管内，混匀后放于PCR仪按如下程序操作,扩增条件：94 ℃ 30s ，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环，72 ℃延伸7 min；

（4）电泳操作程序：  

称1g 琼脂糖放于锥形瓶中，加入50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液100 mL，于微波炉中熔解，在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将7μL PCR 扩增产物加上2μL染色液混匀后点样于琼脂糖凝胶孔中，以120V电压于50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。