[发明专利]一种多元肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物及其制备方法

权利要求书

1.一种多元肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物，其特征是，包含13种肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质的结合物和增强免疫的佐剂，每一种肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质的结合物由对应的血清型肺炎球菌荚膜多糖通过共价键与同一种蛋白载体的结合，所述13种肺炎球菌荚膜多糖是从肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F细菌通过纯化提取获得，所述蛋白载体是由基因重组大肠杆菌表达获得的白喉毒素突变体CRM197的A链，所述白喉毒素突变体CRM197的A链基因的核苷酸序列为：

2.根据权利要求1所述多元肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物，其特征是，所述佐剂为磷酸铝或氢氧化铝。

3.权利要求1所述多元肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物的制备方法：

第一，白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的制备

步骤1，白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白基因片段的构建

用PCR方法合成CRM197的A链核苷酸序列，包含有Nco I酶切识别位点CCATGG的限制性内切酶识别序列和含有Bam H酶切识别位点GGATCC的限制性内切酶识别序列，上述两个限制性内切酶的识别序列分别与白喉毒素突变体CRM197的A链基因序列的5’端和3’端连接，得到白喉毒素突变体CRM197的A链的重组基因片段；

步骤2，表达白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的质粒构建

用Nco I/Bam H限制性内切酶消化PCR方法合成CRM197的A链核苷酸基因片段，纯化后，将消化获得的基因片段克隆至一个表达载体中，获得表达白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的质粒；

步骤3，白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的制备

将步骤2获得的表达白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的质粒转入大肠杆菌表达宿主BL21中，获得表达白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的大肠杆菌表达菌，通过对白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的大肠杆菌进行培养、诱导后，从菌体中分离、纯化得到白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白；

第二，13种血清型肺炎球菌荚膜多糖的制备

通过对13种血清型肺炎球菌分别进行发酵，菌液分离后，取离心上清液，进行荚膜多糖的纯化，获得相应的血清型肺炎球菌荚膜多糖；

第三，13个血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的合成

将第二获得的13种纯化的肺炎球菌荚膜多糖分别与第一步骤获得的白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白共价键连接，得到13种肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物；

第四，13价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物的制备

将第三获得的13种肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物和增强结合物免疫性的佐剂进行均匀混合即得目标物。