[发明专利]一种用于细胞培养的组织块的冷冻保存方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物冷冻保存技术，具体是一种用于细胞培养的组织块的冷冻保存方法。

背景技术

随着生物技术的快速发展，细胞培养技术已广泛应用于生物学、医学、畜牧学等生命科学领域，成为科研或生产中不可或缺的技术手段。目前，动物机体几乎所有的组织经简单机械或蛋白酶处理后接种到培养瓶中，在适宜的培养条件下都能增殖扩繁（Spier RE.Large-scale mammalian cell culture: methods, applications and products. Curr Opin Biotechnol. 1991 Jun;2(3):375-9）。然而研究表明，这些细胞在体外培养的传代次数不能过多，否则会出现细胞生长缓慢、老化以及生物学功能逐渐丧失等不良现象。因此，如果试验或生产中要重复进行、多次培养细胞时，那就需要不断采集新鲜组织。

由于细胞培养时所取组织应该尽可能无细菌或病毒污染、同时具有较强的增殖活性，所以取样时通常将组织放在含抗生素的液体如磷酸盐缓冲液（PBS）或生理盐水中保存，尽快（3-4小时内）送回实验室处理。如果取样现场距离实验室较远或交通不方便的情况下，组织在液体中保存时间过长，那么会造成细胞活性降低，接种后细胞生长缓慢；而且由于取样通常并不是在无菌环境中，时间过长也会造成液体中细菌大量增殖，培养后容易发生污染。因此，如果能将组织进行冷冻保存，在下次细胞培养时直接解冻、复苏组织而不需再次取样，这样就极大地避免了麻烦及浪费，也能够最大限度地利用材料；而且如果所取样品为珍稀、甚至是濒危灭绝动物的稀缺组织，冷冻保存组织的意义就更不可估量。

组织冷冻保存时，渗透性冷冻保护剂如二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇或甘油等必须渗透进入细胞质中才能起到保护作用，防止组织细胞内冰晶的生成。然而如果组织过大，则不利于冷冻保护剂穿透进入，影响冷冻保存效果。尽管目前有组织块冷冻保存成功的报道（孙苏军，安志兴，彭新荣，张涌.山羊乳腺组织块冷冻保存实验，西北农林科技大学学报（自然科学版）,2005,33(4):5-8），但该冷冻方法操作过程非常繁琐、费时，具体表现为：先加基础液，冰上预冷15min，放入组织块后在摇床上平衡6h；分两次添加DMSO；冷冻时0℃平衡1h，-20℃平衡2h。同时保存组织块的数量较少（每管仅冻存6块），而且复苏后组织块的存活率（最高存活率为89.8%）还需进一步提高。

发明内容

 为了解决细胞培养时组织取样存在的问题，改善目前组织块冷冻保存方法存在的技术缺陷，本发明提供了一种用于细胞培养的组织块的冷冻保存方法。本发明在冷冻前先将组织处理成小的组织块，这步处理实际上等同于细胞培养时的组织块剪碎处理，组织块解冻后就可直接接种到培养瓶内培养或经蛋白酶消化成单个细胞后培养。该方法操作步骤简单、花费时间短，一次能冻存较多数量的组织块，复苏后组织块贴壁存活率高达96%以上。

本发明的技术方案是：一种用于细胞培养的组织块的冷冻保存方法，其特征是，先将新取的动物组织匀浆处理成乳糜状，然后加入冷冻液混匀，分装到冷冻管中，之后放置在冷冻保存盒中-80℃超低温冰箱过夜，最后放入液氮中长期保存。

具体包括以下步骤：

（1）冷冻液组分与配制

每100ml冷冻液含有：二甲基亚砜（DMSO）9-11ml、Supercool X-1000 0.8-1.5 ml、胎牛血清（FBS）15-20 ml、谷胱甘肽0.15-0.25g、蔗糖1-2g 和DMEM/F12液75.2-67.5ml；冷冻液经0.22微米滤膜过滤后4℃保存；

      （2）组织匀浆处理

在无菌超净台内首先将组织放在平皿中修剪成1.0-1.2cm³的块状，然后用PBS液彻底冲洗5-8遍，之后把组织块放在干燥的平皿内沾3-5下，让组织块稍微干燥后，放入组织匀浆机的无菌试管内，180-200转/分钟匀浆处理3-5分钟，这时组织块成乳糜状；

      （3）组织块的冷冻

      冷冻时，先用吸管将乳糜状组织块放入离心管内，根据组织块的体积加入8-10倍量的冷冻液混匀，然后按每管5毫升分装到冻存管中，之后放置在冷冻保存盒中-80℃超低温冰箱过夜，次日将冻存管转入液氮中长期保存（注：从加入冷冻液到将冷冻保存盒放置在超低温冰箱中整个操作时间在5-8分钟内完成，且室温维持在22-25℃）。

解冻方法：解冻时依次经过解冻液、培养液离心洗涤，之后组织块可直接接种培养或经蛋白酶消化成单个细胞后培养。