[发明专利]一种水稻人工微染色体的构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中水稻人工微染色体的构建方法。 

背景技术

作为现代生物技术的核心，基因工程技术从发展至今已经经历了三十多年，并取得了重大的成就，但是其应用仍存在诸多问题及挑战。随着研究技术的不断发展，研究也越来越深入，并进入了后基因组研究时代，并且各种动植物基因组序列的面试，也为基因工程技术提供了更广阔的信息平台，大大推动了农牧业、食品、环保等领域的发展进程。 

植物基因工程技术主要是将外源基因构建到可表达的重组载体中，并通过农杆菌介导或者通过粒子轰击转化到宿主基因组中表达，最终改变植物性状。随着研究的不断发展，局限性也愈发明显，归纳来有这几方面： 

一是在遗传转化过程中，由于外源基因(DNA)随机插入到宿主基因组中，从而导可能致自身基因插入失活；二是外源基因的表达可能受其插入位点上游或下游调节元件的影响；三是传统的转基因方法实现多基因的共转化难度较大；四是在转基因过程中，由于外源基因会以多拷贝形式整合，可能会引起表达量低、基因沉默及转基因的不稳定等情况；转化的随机性经常将转基因置于染色体不同位置或不同染色体上，多个基因很难协调表达。 

虽然插入失活和位置效应可以通过现有的筛选技术尽量消除，而多基因转化则大大地限制了对数量性状基因及代谢途径中多个基因协同作用的研究。如何有效地实施基因叠加(genestacking)，则是未来转基因研究的主要挑战和目标。有效地实施基因叠加就需要寻找新的转基因载体，如将外源基因通过游离病毒载体进行表达，或者通过工程细胞器、人工微小染色体等进行多基因的叠加。 

植物人工染色体是一种采用遗传工程技术，从植物染色体中分离控制染色体复制的主要组件，包括：端粒、着丝粒及自主复制序列等，加上人工选择标记、外源基因克隆位点等遗传转化等构件进行组装，形成能自主复制、独立分离的、能携带大的基因组DNA片段的人工微染色体载体。具备染色体的部分功能，也具有载体功能，由于人工染色体微小，不能与宿主染色体配对，在细胞周期中以附加体形式存在。植物人工染色体可以在附加染色体上提供稳定的多基因表达，为解决多个基因同时转化的问题提供了解决方法，是新一代的转基因载体。例如，微染色体可以同时表达多种抗性基因(抗虫、抗细菌、抗真菌、抗除草剂、抗逆)，还可以表达提高作物品质的基因。 

植物人工染色体的研究起步较晚，主要参照动物和人类中人工染色体的构建方法。目前，植物人工染色体构建策略主要有2种，一种是以自身染色体为基础，通过必要的加工产生， 如端粒介导的染色体截断技术；第二种以染色体的功能元件为基础组装产生。从着丝粒入手，这种方法主要是基于双着丝粒染色体的产生，通过着丝粒卫星DNA序列和其它宿主序列的克隆结合转基因的方法形成双着丝粒染色体；另外，通过克隆着丝粒并在体外拼接形成新染色体的方法已有成功的报道，在玉米人工微小染色体研究中，Carlson等在体外将标记基因、筛选基因及着丝粒重复序列连接成环，通过粒子轰击将这段DNA序列转化到玉米细胞中，在细胞中完成微小染色体的组装，这种染色体在有丝分裂和减数分裂过程中可以稳定遗传。Ananiev等将玉米的着丝粒序列、端粒序列及选择标记基因等在体外连接，通过粒子轰击的方法导入宿主细胞中，最终组装成为微小染色体。 

无论是基于天然染色体改造的自上而下策略，还是将克隆的染色体功能元件人工组装的自下而上策略，在哺乳动物和人类细胞研究中都有了长足的进步，而在植物中的研究都只是处于起步阶段，特别是在主要粮食作物-水稻上，De Novo构建水稻人工微染色体还没有成功的报道。 

虽然目前植物人工染色体的研究离实际应用还有很大距离，要成为转基因载体还需要解决很多问题也是未来植物基因工程的重要发展方向，但随着人们研究的深入和技术的发展，其广阔的应用前景和巨大的商业价值会更加受到人们的重视。 

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻人工微染色体的构建方法和一套水稻人工微染色体。 

本发明提供了水稻端粒序列及含中心粒的亚克隆在构建水稻人工微染色体的应用。 

本发明提供了构建含中心粒序列、端粒序列、筛选标记、报告基因等元件的水稻人工染色体的技术方案。 

本发明通过组装染色体必备元件：中心粒、端粒、筛选标记、报告基因等，构建了一套水稻人工微染色体。本发明为研究中心粒、端粒等的行为和功能，同时为多基因或大片段DNA遗传转化提供新一代的载体，具有十分重要的理论和实际意义。 

附图说明

图1为高密度膜杂交结果展示图