[发明专利]越南伯克霍尔德氏菌P418杀线虫活性物质的颗粒剂及其制备

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及越南伯克氏菌P418杀线虫活性物质的提取与应用。 

背景技术

线虫病是危害植物的重要病害，全世界已记载的植物线虫有200多属5000多种，一旦发生难于防治和根除。据统计，全世界主要农作物因寄生线虫造成的年均损失率为12.3 %，1992 年我国种植业因线虫造成的损失达233亿元。目前，植物线虫病在我国各地均有不同程度的发生，且危害呈逐年加重趋势（郭衍银，徐坤，生姜根结线虫病原鉴定及发生规律[J]，植物保护学报，2004，31（3）：241-246）。当前，生产上普遍应用的防治策略是化学防治，但由于化学杀线剂大多数是高毒、高残留农药，长期使用会造成环境污染，危害人类健康。因此，研究开发高效低毒的生物杀线剂成为农业可持续发展中的重要问题。

植物寄生线虫生防细菌的研究是近几年兴起的新的研究热点。目前主要研究的有植物根围促生细菌、穿刺巴氏杆菌、假单胞杆菌、苏云金芽孢杆菌等，它们在线虫生物防治中有着巨大的开发潜力，其价值也为人们逐渐认识（田宝玉，黄薇，植物寄生线虫生防细菌及其作用机制研究[J]，生 物 技 术，2009 年19(4) ：90－93）。越南伯克霍尔德氏菌( Burkholderia vietnamiensis )P418是本申请人保存的一株生防细菌，在研究中，我们发现P418菌株能够有效防治根结线虫病。田间试验表明，其可湿性粉剂对番茄根结线虫病的防治效果达63.42%，连续施用P418菌株可湿性粉剂后，土壤根结线虫数量显著减少（李纪顺，陈凯，伯克霍尔德氏菌P418的生物学特性[J]，中国植物病理学会2004年学术年会论文集）。室内毒力测定结果显示，P418发酵液上清处理2龄根结线虫48h后校正死亡率达70%以上，可见，P418菌株能产生杀线活性物质，如果能将其中的杀线活性物质提取出来，有望进一步提高杀线效果。 

发明内容

针对现有技术的不足，为进一步获取越南伯克霍尔德氏菌P418所产生的杀线虫活性物质，本发明人提取并纯化了越南伯克霍尔德氏菌P418菌株发酵液中的两种活性物质，经鉴定，两种活性物质分别为：

六氢-3-（异丙基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮（Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione,hexahydro-3-(2-methylpropyl)），下称化合物Ⅰ，和六氢-3-（苯甲基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮（Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione,hexahydro-3-(phenylmethyl)），下称化合物Ⅱ；分子式分别为C₁₁H₁₈N₂O₂ 和C₁₄H₁₆N₂O₂ ；分子量分别为211 和244；分子结构分别为：

和。

并以此二种化合物为主要活性成分，按不同比例制备了用于杀线虫的颗粒剂，经比较，得到最高杀线活性的化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的重量配比为                         （1～2） : 1。

具体由以下措施实现：

1、越南伯克霍尔德氏菌P418发酵液中活性组分的分离提取及纯化鉴定，步骤如下，

（1）用液体培养基（g/l）蛋白胨8～10g，酵母粉0.5～1g，氯化钙0.1～0.5g，氯化钠0.2～0.5g，pH7.0～7.5培养越南伯克霍尔德氏菌P418。

（2） 将培养好的发酵液8000 r/min离心，上清液用2倍体积氯仿萃取2次，合并有机相，减压浓缩除去氯仿，得粗提物。 

（3）将上述粗提物过真空减压－硅胶柱(5×100 cm)，以不同比例的二氯甲烷－甲醇进行洗脱，甲醇－二氯甲烷的体积比分别为0:100(A)、1:100(B)、3:100(C)、5:100(D)、10:90(E)、20:80(F)、30:70(G)、50:50(H)、0:100(I)，各1000 mL，洗脱液以体积比为单位进行收集，测定各单位的杀线虫活性。

（4）将高活性组分过Sephadex LH-20凝胶柱 (1.5×60cm)，用石油醚-甲醇-二氯甲烷（体积比为2：1：1）进行洗脱，洗脱液以5ml为一个单位进行收集，测定各单位的杀线虫活性。