[发明专利]一种香菇多糖快速分离的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种香菇多糖快速分离的方法，特指离子液体[Bmim]Cl/无机磷酸盐K₃PO₄组成的离子液双水相体系快速分离香菇多糖的方法，属于生物大分子分离纯化技术领域。

背景技术

香菇（Lentinula edodes）又名香蕈、冬菇，为担子菌纲伞形科真菌，是食用兼药用菌之一，香菇多糖（Lentinan）是其主要活性成分，具有抗肿瘤、调节免疫、抗病毒、抗过敏、抗炎等功能。香菇多糖虽然具有明确的药理活性，但要应用于临床，特别是作为注射用药物，必须具有足够的纯度，香菇多糖的分离纯化技术美国、日本处于领先地位，并受到专利保护。国内大多香菇多糖生产厂家生产的多糖都是纯度较低的产品，一般也只能应用于功能性保健食品领域。

香菇多糖的分离纯化方法很多，如乙醇分级沉淀、离子交换色谱、凝胶过滤色谱和膜过滤等，必须根据多糖的性质巧妙的选择正确的分离纯化方法，才能够获得均一的活性成分。其中，乙醇分级沉淀是一种简单且行之有效的方法，但在提取多糖的同时蛋白质也随之沉淀下来，而且蛋白质含量随乙醇浓度增加而增加，这为后续多糖纯化带来一定困难。此外，离子交换色谱和凝胶过滤色谱是多糖分离纯化过程中应用最普遍的一种方法，但纯化过程具有耗时长、费用高、产品回收率低、溶剂用量大和操作繁琐等缺点，因而限制了香菇多糖的工业化应用和开发。

近年来，作为一种高效而温和的新型绿色分离体系，离子液体双水相体系结合了离子液体和双水相萃取的优点，广泛地应用于蛋白质、抗生素、生物碱、药物和小分子有机化合物的分离和纯化，而且在萃取过程中保持了原有生物物质的活性及构象。在多糖分离纯化方面，Tan等应用亲水性离子液体l-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[Bmim]BF₄）和NaH₂PO₄形成的双水相体系并结合透析的方法同时提取和分离了芦荟多糖和蛋白（Tan et al., Desalination, 2012, 286: 389-393）。亲水性离子液体l-丁基-3-甲基咪唑氯盐（[Bmim]Cl）和无机磷酸盐如K₃PO₄、K₂HPO₄也能够形成良好的双水相体系。经检索，应用离子液体[Bmim]Cl和无机磷酸盐形成的离子液双水相体系分离活性多糖的研究文献或专利还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有香菇多糖分离纯化技术的不足，在保证多糖结构和活性不受影响的前提下，提供一种快速分离香菇多糖的方法，即[Bmim]Cl/K₃PO₄离子液双水相体系快速分离香菇多糖的方法。

一种香菇多糖快速分离的方法，按照下述步骤进行：

1）香菇子实体粉碎，过筛，石油醚回流脱脂3次，自然晾干；

2）将上述香菇粉用热水提取3次，离心收集上清液，浓缩，4倍体积95%乙醇沉淀，4℃静置过夜，离心收集沉淀，冷冻干燥，得到香菇粗多糖；

3）将上述粗多糖溶于水配成一定浓度（5~15 mg/mL），取1 mL，加入由离子液体[Bmim]Cl （1.0 g）、无机磷酸盐K₃PO₄（1.75 g~2.50 g）和4 mL水组成的离子液双水相体系中，充分振荡，25℃~50℃恒温水浴中静置30 min，分离上下两相；

4）将含有香菇多糖的下层无机盐相蒸馏水透析3天，浓缩，冷冻干燥，得到香菇多糖；

5）将含有蛋白质等杂质的上层离子液相浓缩（≤45℃），二氯甲烷萃取3次，二氯甲烷相浓缩（≤45℃），回收离子液体[Bmim]Cl，重复使用。

其中离子液体[Bmim]Cl的结构式为：   

本发明公开了一种[Bmim]Cl/K₃PO₄组成的离子液双水相体系快速分离香菇多糖的方法，以下层无机盐相中多糖提取率为指标，优化分离条件，达到“绿色”、高效、快速分离香菇多糖的目的。本发明方法适合于大规模工业化生产活性多糖，离子液体可循环使用，降低生产成本，且能普遍应用于真菌多糖的分离纯化。

具体实施方式