[发明专利]一种灰树花菌丝体抗肿瘤糖蛋白及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有抗肿瘤等活性的灰树花深层发酵菌丝体糖蛋白及其制备方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

食药用真菌有效成分的分离及其结构的测定是目前研究热点之一。食药用真菌所含有有效成分的种类及其含量直接决定不同的生理活性和功能，因此不同的真菌代谢产物具有其独特的化学组成和生理活性。真菌多糖及其复合物与蛋白质、核酸并称为最重要的三种生物大分子。随着对多糖类化合物的分离、纯化、组成测定和结构分析等手段的进一步提高，人们对多糖类化合物的生物学功能（例如在细胞识别、细胞间物质运输、免疫调节、抗辐射及抗肿瘤等方面的作用）的认识也不断深入。

近年来诸多研究表明，多糖复合物类大分子物质也具有体外直接的抑制肿瘤细胞增殖的作用，例如，PLG-3，是一种从桑黄深层发酵菌丝体中提取分离出的糖蛋白，含有85.5%的蛋白和13.7%的多糖，能抑制肠癌A549细胞和肝癌HepG2细胞的增殖。Wang等人，以云芝发酵菌丝体为原料，通过Sepharose 6B和Sephadex G-50分离获得了一些小分子的糖肽，经体内试验研究表明它能刺激小鼠淋巴细胞和巨噬细胞的增殖，但是对纤维母细胞、肝癌细胞和绒膜癌细胞并没有直接的细胞毒活性。AAL，是从杨树菇中提取出的一种对人体Hela、SW480和SGC-7901细胞系及小鼠腹水瘤细胞S-180均具抑制作用的凝集素，经鉴定它的N-端序列为QGVNIYNI。

灰树花是一种珍贵的食药兼用型真菌，隶属于担子菌纲多孔菌科。多年以来灰树花生产主要以人工固体栽培为主，但固体栽培存在占地面积大、生产周期长、产量不稳定、劳动强度大，易受气候、环境因素影响等诸多缺点，产量难以大幅度提高。如果采用子实体提取多糖其其复合物，成本昂贵，且不满足工业化生产的需求；而利用液体深层发酵法可使灰树花生产工业化，可以大幅度降低提取多糖及其复合物的成本，缩短周期，增加产量，稳定质量。研究发现深层发酵得到的灰树花菌丝体，不但具有固体栽培子实体相当的营养及药用效果，还可得到胞外多糖等子实体所不具备的营养保健成分，因此灰树花深层发酵菌丝体可以替代子实体作为产品深度开发的原料。

目前，灰树花活性成分的研究，主要集中在灰树花子实体多糖、蛋白质和糖肽等，例如专利（CN 1872875A）公开了一种灰树花子实体抗病毒蛋白及其提取方法和用途，专利（CN 1634983A）公开了一种具有免疫活性与抗肿瘤活性的灰树花子实体蛋白聚糖，专利（CN 1398898A）公开了一种灰树花子实体糖肽，为制备各种适应症的药物提供了可能。以上公开的专利，在提取多糖及其复合物的过程，都用到了乙酸和强碱等试剂，甚至涉及了脱蛋白等有可能损害产品活性的步骤，这在一定程度上限制了该类产品使用的广泛性，同时也影响产品的安全性。

然而，对灰树花深层发酵菌丝体中糖蛋白或糖肽的纯化方法、结构分析和生物活性的研究还未见报道或技术保护。为了进一步促进灰树花活性成分的研究和推进开发新型抗癌药物的潮流，本发明以灰树花深层发酵菌丝体为原料，采用水提盐析结合柱层析的方法，简便安全地分离纯化出了一种高纯度的灰树花菌丝体糖蛋白，并通过胶上酶解结合MALDI-TOF-MS的手段初步测定出了它的氨基酸序列，且经体外实验证明了该糖蛋白对人胃癌细胞SGC-7901和人乳腺癌细胞MCF-7增殖有显著的抑制作用。成果可广泛应用于药食用真菌糖蛋白的提取分离纯化等领域，具有巨大的实用价值和经济价值。

 

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤活性的深层发酵灰树花菌丝体糖蛋白及其制备方法。该方法是利用生物工程发酵技术培养灰树花菌丝体，并从中提取出具有抗肿瘤活性的灰树花菌丝体糖蛋白，获得其基本的理化性质，所用方法步骤清晰，方便操作。这种糖蛋白可用于生产保健产品或进一步开发成新的天然抗癌药物。

为实现本发明的上述目的：本发明的技术方案如下：

一种具有抗肿瘤活性的灰树花菌丝体糖蛋白，该糖蛋白中多糖含量为2～10%，由阿拉伯糖，果糖，甘露糖和葡萄糖4种单糖组成；蛋白质含量为30～90%，由天冬氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等17种氨基酸组成；其分子量范围为30～90 KDa。

上述具有抗肿瘤活性的灰树花菌丝体糖蛋白的制备方法，按照下述步骤进行：