[发明专利]一种端粒酶活性检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及端粒酶活性检测领域，具体是通过比色法和SERS技术双信号通道检测端粒酶活性。

背景技术

真核生物线性染色体末端由被称作“端粒”的DNA-蛋白质复合物保护，避免染色体DNA的降解、末端融合、非正常重组等。由于DNA的末端复制问题，随着细胞分裂，端粒DNA不断缩短，细胞逐渐老化、丧失增殖能力并死亡。端粒酶是一种能以自身RNA为模板合成并延伸端粒序列，从而维持端粒长度和结构稳定的核糖核蛋白。端粒酶在正常体细胞中被抑制，只在干细胞和生殖细胞中表达。端粒酶的过度表达与细胞的永生化和癌变有着密切的关系。已有研究表明，85-90%的肿瘤细胞过度表达端粒酶。因此，端粒酶的激活在癌细胞获得永生性的过程中起到重要作用，而抑制端粒酶的活性将杀死肿瘤细胞。这使得端粒酶成为一种新的肿瘤标志物和抗癌药物设计靶点，端粒酶活性是癌症诊断和评估抗癌药物效果的重要指标之一。

基于端粒重复序列扩增的TRAP法及其改进版本是最常用的端粒酶活性检测技术，它通过PCR扩增端粒酶合成的端粒序列，大大提高了检测灵敏度。但TRAP法费时且要求高，易受诸多因素的制约而造成假阴性的结果。近年来，人们开发出了几种无需PCR反应的端粒酶活性测试技术，包括电化学法、比色法、化学发光法、表面等离子激元共振法、荧光共振能量转移法等。尽管这些方法避开了PCR反应的缺点，却或多或少依旧面临着灵敏度低、程序复杂、成本高等不足。因此，设计出灵敏度高、准确性好、适用性广泛、可操作性强的端粒酶活性测试方法仍是基于端粒酶的癌症诊疗中急需解决的问题。

比色法快速、简单，其结果能直接通过裸眼观察，是一种有效的检测手段。然而，比色法一般难以实现较高的灵敏度。表面增强拉曼散射光谱（surface enhanced Raman scattering,SERS）技术作为一种新兴的生物标记手段，是当前国际上备受瞩目的研究热点。SERS一方面继承了拉曼光谱的诸多优点，如光信号不易漂白、对生物组织损伤小、光谱信息丰富等；另一方面，它弥补了传统拉曼散射信号强度弱、不利于检测的缺点。SERS光谱的“指纹”特性使人们能在复杂的生物环境中跟踪、检测目标分子。此外，SERS效应巨大的增强作用使基于SERS的光谱检测具有超高的灵敏度，甚至可实现单分子水平的分析研究。SERS效应产生在纳米尺度粗糙的金属表面，纳米技术的飞速发展为构筑多功能化的SERS纳米探针提供了丰富的技术途径。这些基于SERS光谱技术的纳米探针在生物成像、核酸或蛋白检测、肿瘤识别、药物输运等诸多生物医学领域展现出了优异的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种端粒酶活性检测方法，通过比色法和SERS技术双信号通道反应端粒酶活性，一方面通过比色法，能快速定性地区分端粒酶活性不同的样品，另一方面，通过SERS技术对样品的端粒酶活性进行精确的定量分析，解决了现有技术中端粒酶活性检测灵敏度低、程序复杂、成本高等问题。

为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：

一种端粒酶活性检测方法，通过比色法和SERS技术双信号通道检测端粒酶活性，包括如下步骤：

第一步，利用CHAPS法提取待测细胞中的端粒酶，得到待测端粒酶提取物；

第二步，利用捕获基底和待测端粒酶进行延伸反应，延伸反应产物与报告标签溶液进行杂交反应；所述的捕获基底为金壳包裹的四氧化三铁纳米粒子表面连接端粒酶底物；所述的报告标签为球形金纳米粒子表面连接端粒互补序列和拉曼分子；

第三步，杂交反应产物通过比色法观察颜色或采用SERS技术双信号通道检测得到SERS信号。

所述捕获基底为核壳结构，由内核层、中间壳层、外壳层组成，所述内核层为四氧化三铁纳米粒子，所述中间壳层为二氧化硅壳层，所述外壳层为金壳层；所述二氧化硅壳层表面修饰氨基，所述金壳层表面连接端粒酶底物。

所述四氧化三铁纳米粒子采用溶剂热法制备，所述二氧化硅壳层采用改进的法制备，所述金壳层采用种子生长法制备。

所述端粒酶底物的序列为5'-SH(CH₂)₆TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3'，如SEQ ID NO.1所示；所述端粒酶底物通过金-硫键以共价方式连接在捕获基底的金壳层表面。

所述球形金纳米粒子采用柠檬酸钠还原法制备。