[发明专利]一种蛋白质烷基化修饰剂PEG修饰能力的检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种蛋白质烷基化PEG修饰剂修饰能力的检测方法和应用。

背景技术

20 世纪50 年代末期，用化学修饰的方法研究蛋白质分子的结构与功能的关系成为生物化学和分子生物学领域的热点。蛋白质化学修饰的目的是用于生物医学和生物技术方面。在生物医学方面，化学修饰可以降低免疫原性的免疫反应性、抑制免疫球蛋白E 的产生等；在生物技术领域， 酶经过化学修饰后能够在有机溶剂中高效地发挥催化作用，并表现出新颖的催化性能。

蛋白质修饰剂与蛋白质发生反应的性质，主要可以分为四种类型：（1）酰化及其相关反应，这类修饰剂可以与蛋白质的侧链基团发生酰基化反应；（2）烷基化反应，这类修饰剂的特点是带有活泼的卤素原子，由于卤素原子的电负性，使烷基带有部分正电荷，很容易导致蛋白质分子的亲核基团发生烷基化；（3）氧化和还原反应，这类修饰剂具有氧化性，能将侧链基团氧化；（4）芳香环取代反应，蛋白质氨基酸残基的酚羟基在3和5位上很容易发生亲电取代的碘化和硝化反应。有代表性的修饰剂有乙酰咪唑、卤代乙酸、N-乙基马来酰亚胺、碳化二亚胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、N-卤代琥珀酰亚胺、乙二酸/ 丙二酸的共聚物、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯/ 顺丁烯二酰肼共聚物、多聚唾液酸、聚氨基酸、葡聚糖、环糊精、聚乙二醇（PEG ）等。其中，PEG溶解性好，毒性低，无免疫原性，蛋白质经其修饰后不但保持了水溶性而且在有机溶剂中的溶解性也增加了，因此PEG 类修饰剂应用最多。

由于PEG的醇羟基化学性质不活泼，所以必须通过特定的活化剂与其反应使之活化。其中氰尿酰氯法是比较经典的方法。该法具有活化反应操作简单、所活化的PEG修饰能力强、修饰蛋白质稳定性高等优点，是目前最常用的PEG 活化方法之一。经氰尿酰氯活化后的PEG带上卤素原子，由于卤素原子的电负性，使烷基带有部分正电荷，很容易导致蛋白质分子的亲核基团（例如-SH，—NH2等）发生烷基化反应，且巯基基团是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。因此活化的PEG修饰剂很容易与蛋白质中的巯基与氨基发生反应。

但是氰尿酰氯也存在着易水解的问题，水解后的氰尿酰氯即失去活化PEG的能力，此外活化后修饰剂的放置时间对其修饰能力产生很大影响，通常情况下，随着活化PEG在冰箱中放置时间的延长，其修饰蛋白质的能力会越来越低，并最终失去修饰能力。另外在制备PEG修饰剂的过程中，随着操作及反应条件的变化，PEG修饰能力也会有较大的差异。所以及时了解和掌握PEG修饰剂修饰蛋白质的能力具有重要的意义。

目前还没有理想有效的测定各种活化PEG修饰蛋白质的能力的方法的相关报道。常远等（1996）以牛血清白蛋白（BSA）为模型蛋白，采用凝胶电泳法来测定各种活化PEG的修饰能力，但该方法操作麻烦、操作时间长、结果不理想，而且不能定量的检测活化PEG修饰蛋白质的能力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有检测活化PEG修饰蛋白质的能力的技术不足，提供一种检测蛋白质烷基化PEG修饰剂修饰能力的方法，该方法既能实现定性检测又能实现定量检测，快速、简便、可靠。

本发明的另一目的是提供所述方法的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种蛋白质烷基化修饰剂修饰能力的检测方法，包括以下步骤：

S1. 测定组：按照2:1的摩尔比分别准备修饰剂与谷胱甘肽（GSH）溶液；对照组：谷胱甘肽（GSH）溶液；

S2.将S1测定组准备好的修饰剂与谷胱甘肽溶液进行反应，反应体系的pH值为8.0～10.0、反应温度为35℃～55℃、反应时间为30～50min；

S3.S2所述反应结束后分别在测定组和对照组加入显色剂DTNB得混合体系，在波长412nm下于3～6min内分别测定混合体系的吸光值；

S4.根据S3测定的测定组和对照组混合体系的吸光值差异计算出修饰剂的修饰能力。

本发明所述活化的蛋白质烷基化修饰剂优选为活化的聚乙二醇。

作为优选的修饰剂活化方法，包括以下步骤：

S11.用无水苯重结晶三聚氰氯；优选重结晶2次；所述无水苯经3A分子筛除水；

S12.取S11处理的三聚氰氯溶解于含无水碳酸钠的无水苯中，加入单甲氧基聚乙二醇mPEG，室温下搅拌过夜后过滤；

取滤液在搅拌下加入乙醚，得白色沉淀，继续搅拌后抽滤，所得沉淀用无水苯溶解；上述沉淀、溶解重复操作多次，直到紫外检测无三聚氰氯的吸收峰为止；