[发明专利]一种鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法

权利要求书

1.一种鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤，（1）制作切片：将鸭的骨骼肌肉利用液氮-异戊烷体系冷却，采用冷冻切片法制作出切片；

（2）漂洗切片：将（1）步制作好的切片置于载玻片上，在室温条件下，自然晾干至切片发白，利用Tris洗液漂洗两次，每次漂洗1min；

（3）切片的第一次孵育处理：经（2）步处理的切片置入碱性预孵育液中，在20～30℃条件下孵育15min，碱性预孵育液的成份包括氯化钙、甘氨酸、甲醛、氢氧化钠；

（4）切片的第二次孵育处理：经（3）步处理的切片利用Tris洗液漂洗后，在滤纸上将切片上的液体吸干，置入ATP孵育液中，在温度为37℃的培养箱中孵育60min，ATP孵育液的成份包括甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、氯化钙、ATP；

（5）切片的染色处理：①经上步处理的切片用质量浓度为13.3g/L氯化钙溶液洗涤4次，每次1～2min；②将切片用滤纸吸干后浸渍在质量百分浓度为2%的氯化钴溶液中3min；③用纯水冲洗切片4次，每次1～2min；④再将切片浸渍在质量百分浓度为2%的硫化铵溶液中3～4min；⑤用流水冲洗切片3min后，纯水再清洗一次；⑥最后依次用体积百分浓度为50%、70%、96%、100%的乙醇溶液将切片脱水，用二甲苯透明后中性树胶封片； 

（6）经上步染色处理后的切片用照相显微镜观察并拍照，利用Image Pro-plus 6.0软件测得的不同光密度值即可判定鸭骨骼肌中肌纤维的类型。

2.根据权利要求1所述鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，其特征在于，步骤（1）将鸭的骨骼肌肉利用液氮-异戊烷体系冷却后，再移入放有干冰的封闭箱中冷冻1h。

3.根据权利要求1所述鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，其特征在于，步骤(2)和（4）中Tris洗液的配制方法为，在20～30℃条件下，将Tris碱、质量浓度为19.98g/L氯化钙溶液、质量百分比浓度≥37%的盐酸、纯水混合即可，各成份在Tris洗液中的含量为，Tris碱的质量浓度为10～13g/L，氯化钙溶液的体积百分比为8～12%，纯水的体积百分比为88～92%，添加盐酸的量为直至Tris洗液的PH值为7.3～7.4时停止。

4.根据权利要求1所述鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，其特征在于，步骤（3）中的碱性预孵育液的配制方法为，在20～30℃条件下，将氯化钙、甘氨酸、质量百分比浓度为37%的甲醛、质量浓度为4g/L的氢氧化钠混合即可，各成份在预孵育液的量为，氯化钙的质量浓度为8～12g/L，甘氨酸的质量浓度为5～8g/L，甲醛的体积百分比为8～12%，纯水的体积百分比为88～92%，添加氢氧化钠的量为直至碱性预孵育液PH值为10.39～10.41时停止。

5.根据权利要求1所述鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，其特征在于,步骤（4）中ATP孵育液的配制方法为，①在20～30℃条件下，将质量浓度为7.51g/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、19.98g/L氯化钙溶液、纯水按照2:1:7的体积比混合；②将上步的混合液加热至37℃；③再在避光的条件下加入ATP，使混合液的PH值为9.59～9.61。

6.根据权利要求1所述鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，其特征在于，步骤（3）中的碱性预孵育液、步骤（4）中的ATP孵育液保存的温度均为-15～-25℃。