[发明专利]一种毒素蛋白及其纯化方法

权利要求书

1.一种毒素蛋白，其特征在于：所述毒素蛋白的N-端序列为:Glu-Ser-Ile-Gln-Thr-Ser-Thr-Tyr-Val-Pro-Asn-Thr-Pro-Asn-Gln-Lys-Phe-Asp-Tyr-Glu-Val-Gly-Lys-Asp-Tyr——。

2.根据权利要求1所述的毒素蛋白，其特征在于：所述毒素蛋白的分子量为28690。

3.一种如权利要求1或2所述的毒素蛋白的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、卵粒提取物的制备：将间斑寇蛛的卵粒进行匀浆，离心后取上清液作为提取液，沉淀研磨后再次提取，重复2-5次，合并提取液，经冷冻干燥或浓缩后，得到卵粒提取物；

b、分子筛层析步骤：将卵粒提取物溶于磷酸缓冲液中，进行分子筛层析分离，通过磷酸缓冲液洗脱，得到洗脱峰，选择经SDS-PAGE检测出的目标峰作为分子筛层析后的目标峰；

c、离子交换层析步骤：将分子筛层析后的目标峰在阴离子交换层析柱上进行离子交换层析，得到洗脱峰，取穿过峰作为离子交换层析后的目标峰；

d、反相-高效液相层析步骤：采用C4反相柱将离子交换层析的目标峰进行脱盐和进一步纯化，收集经过SDS-PAGE确定的目标峰进行冷冻干燥，即得纯化的毒素蛋白。

4.根据权利要求3所述的毒素蛋白的纯化方法，其特征在于：步骤a中的匀浆在缓冲液或水中进行，其中缓冲液的浓度为0.04-1.06mol/L；离心过程具体为：在转速为8000-10000r/min的条件下离心8-12分钟。

5.根据权利要求4所述的毒素蛋白的纯化方法，其特征在于：所述缓冲液的浓度为0.05mol/L；离心时转速为10000r/min，离心时间为10分钟。

6.根据权利要求3所述的毒素蛋白的纯化方法，其特征在于：步骤b中用于分子筛层析的卵粒提取物用磷酸缓冲液配成浓度为2.0-2.8mg/ml的溶液；分子筛层析采用Sephacryl^TMS-200柱层析，规格为2.6cm×60cm；磷酸缓冲液洗脱时的流速为2-2.5ml/min，检测波长为280nm。

7.根据权利要求6所述的毒素蛋白的纯化方法，其特征在于：用于分子筛层析的卵粒提取物用磷酸缓冲液配成浓度为2.5mg/ml的溶液；磷酸缓冲液洗脱时的流速为2.5ml/min。

8.根据权利要求3所述的毒素蛋白的纯化方法，其特征在于：步骤c中的阴离子交换层析柱为Toyopearl DEAD-650E阴离子交换层析柱，规格为5mm×10cm；Tris-HCl缓冲液的浓度为48-52mmol/L，pH为8.0-8.6；梯度洗脱时氯化钠溶液的起始浓度为1-1.2mol/L。

9.根据权利要求8所述的毒素蛋白的纯化方法，其特征在于：所述Tris-HCl缓冲液的浓度为50mmol/L，pH为8.5；梯度洗脱时氯化钠溶液的起始浓度为1.0mol/L。

10.根据权利要求3所述的毒素蛋白的纯化方法，其特征在于：步骤d中脱盐和进一步纯化步骤中，C4反相柱的规格为4.6mm×250mm，采用洗脱液A和洗脱液B进行线性梯度洗脱，洗脱液A为0.05%的三氟乙酸，洗脱液B为含0.05%三氟乙酸的乙腈，洗脱过程中每分钟增加0.8-1.2%的洗脱液B，流速为0.7-1.0m/min，检测波长为280nm。