[发明专利]一种突变的有机磷农药降解酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因生物工程领域，具体涉及一种突变的有机磷农药降解酶基因及其应用。

背景技术

随着科学的发展与社会的进步，越来越多的化合物进入人类的生产与生活环境。同时，许多人工合成且难以被自然环境降解转化的污染化合物进入自然界中，农药就是其中的一种。

目前使用的农药以杀虫剂为主，占总用量的70%；其中有机磷杀虫剂占整个杀虫剂用量的70%以上；而有机磷农药中高毒品种的产量又占有机磷农药产量的70%，这就是所谓结构不合理的三个“70%”。有机磷农药种类繁多，仅我国使用的就有三十余种，它们均具有一个五价磷原子的共性化学结构，其中毒机理是磷原子与乙酰胆碱酯酶共价结合形成磷酰化酶，阻断了乙酰胆碱的水解反应，导致神经系统中乙酰胆碱的累积引发突触的过渡兴奋，抑制神经冲动传导，产生一系列神经综合症，因此对人类与动物造成极大危害。然而，21世纪的农业发展仍离不开农药，如果要完全停止化学农药的生产与使用是不切实际的。因此，在合理使用有机磷农药的前提下，如何减少与消除有机磷农药的污染成为日益严峻的任务。

有机磷降解方面的最初研究是有机磷降解菌株的分离与筛选。1973年Sethunarhan与Yoshida首次筛选并分离出了一株能降解对硫磷与二嗪农磷的黄杆菌（ATCC27551）。到目前为止，已发现了包括细菌、真菌、放线菌和藻类等不同微生物都能降解有机磷农药，其中细菌包括节细菌、假单胞菌、黄杆菌等二十余种，真菌中有木霉、青霉、曲霉等。随着进一步的研究发现，降解菌通过分泌一种能够水解磷酸酯键的酶（即有机磷降解酶）来实现对有机磷农药的降解作用。研究发现各种有机磷农药的结构都是类似的，只是取代基不同，因此一种有机磷降解酶可同时降解多种有机磷农药。分泌有机磷降解酶的天然微生物降解有机磷农药的速度缓慢，同时要求的生长环境条件比较严格，而直接使用有机磷降解酶制剂，降解效率远远高于使用产生这类酶的菌株。有机磷降解酶降解有机磷农药的效率高，只需数分钟就可将所使用农药的80％以上降解掉。到目前为止，多种酶已被鉴定出可用于降解有机磷农药，如从缺陷型假单胞菌（PTE）和放射形土壤杆菌属分离出的磷酸三酯酶。但是，有机磷降解酶在天然菌株中含量过低，提取成本比较高昂。近些年来，对有机磷降解酶的研究已进入分子水平，并取得了巨大的研究进展，不仅加深了对有机磷降解酶分子作用机制的了解，而且为通过基因工程和酶工程改良有机磷降解酶的性质，研制出适用于不同应用领域的有机磷降解酶产品奠定了基础。

大肠杆菌表达的有机磷降解酶（OpdA）在其应用中存在食品安全隐患；同时重组蛋白在大肠杆菌的胞质中以包涵体的形式产生，而包涵体的纯化与复性过程会对酶活力产生一定负面影响。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于通过基因工程技术对现有的有机磷农药降解酶进行氨基酸定点突变，提供一种突变的有机磷农药降解酶基因，以显著地提高该酶的活性和底物亲和性，克服农产品中有机磷农药残留的降解和消除中现有技术的不足，使改造后的有机磷农药降解酶对有机磷农药更敏感。

本发明所要解决的又一技术问题在于将上述定点突变后的有机磷农药降解酶基因在枯草芽孢杆菌表达系统中快速高效地获得表达。用此种方法获得的活性蛋白经过纯化之后便可以获得改造的有机磷农药降解酶，最终达到工业化生产的要求，为研制有机磷农药降解酶制剂产品提供了高活性的酶材料，具有很大的应用价值。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：

一种突变的有机磷农药降解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述突变的有机磷农药降解酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

通过将所述突变的有机磷农药降解酶基因与载体pHT43连接，获得一种含有所述突变的有机磷农药降解酶基因的表达载体。

本发明还提供了所述突变的有机磷农药降解酶基因的表达蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1）利用反向PCR法依次对序列如SEQ ID NO：3所示的有机磷农药降解酶基因的第253位、256位和271位3个氨基酸编码位点进行突变，得到突变的有机磷农药降解酶基因序列并测序验证；

2）将前述突变的有机磷农药降解酶基因的核苷酸序列连接于载体pHT43中，形成有机磷农药降解酶基因表达载体；

3）将前述获得的表达载体转入枯草芽孢杆菌宿主细胞中，形成含有突变的有机磷农药降解酶基因的重组细胞；