[发明专利]一种大规模基因重组方法及其在生产生物基化学品中的应用

权利要求书

1.一种大规模基因重组方法，其特征在于，步骤如下：

1）制备宿主原生质体；

2）提取外源微生物基因组；

3）培养宿主原生质体，离心洗涤后重悬，加入外源微生物tRNA，温和混匀，加入含有外源微生物基因组的培养基中，加入Fusion Buffer进行融合；

4）筛选得到融合子。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述Fusion Buffer含有8-12%PEG8000。

3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述培养宿主原生质体至5-50×10⁷CFU/mL。

4.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

1）制备大肠杆菌宿主原生质体；

2）提取酿酒酵母基因组；

3）培养大肠杆菌原生质体至5-50×10⁷CFU/mL，洗涤后CaCl₂重悬，加入酿酒酵母tRNA，温和混匀，加入含有酿酒酵母基因组的培养基中，加入Fusion Buffer进行融合；所述Fusion Buffer含有8-12%PEG8000；

4）筛选得到融合子。

5.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

1）制备大肠杆菌宿主原生质体；

2）提取枯草芽孢杆菌基因组；

3）培养大肠杆菌原生质体至5-50×10⁷CFU/mL，离心洗涤后CaCl₂重悬，加入枯草芽孢杆菌tRNA，温和混匀，加入含有枯草芽孢杆菌基因组的培养基中，加入Fusion Buffer进行融合；所述Fusion Buffer含有8-12%PEG8000；

4）筛选得到融合子。

6.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

1）制备大肠杆菌宿主原生质体；

2）提取酿酒酵母基因组；

3）培养大肠杆菌原生质体浓度为5-50×10⁷CFU/mL，离心洗涤后CaCl₂重悬，加入9.5-10.5ug酿酒酵母tRNA，温和混匀，加入19.9-20.1uL含有酿酒酵母基因组的培养基中，加入Fusion Buffer；Fusion Buffer组成为：Tris 15-25mM，NaCl 490-510mM，MgCl₂ 15-25mM，PEG8000 8-12%。

4）筛选得到融合子。

7.如权利要求1所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）制备大肠杆菌宿主原生质体；

2）提取酿酒酵母基因组；

3）培养大肠杆菌原生质体浓度为5-50×10⁷CFU/mL，离心后Tris-NaCl洗涤一次，用200uL 0.1M CaCl2重悬，冰浴30min，加入10ug酵母tRNA，温和混匀，加入到400uL含有20uL酵母基因组的液体LB中，加入等体积Fusion Buffer，温和震荡1min，37℃下放置50min，加入10mL LB培养基，37℃下180rpm摇床培养3小时；Fusion Buffer组成为：Tris 20mM，NaCl 500mM，MgCl₂ 20mM，PEG8000 10%；

4）筛选得到融合子。

8.权利要求1所述大规模基因重组方法得到的融合子用于发酵生产生物基化学品。

9.一种应用权利要求1所述方法生产异戊二烯的方法，其特征在于，步骤如下：

1）制备大肠杆菌宿主原生质体；

2）提取枯草芽孢杆菌基因组；

3）培养大肠杆菌原生质体至一定浓度，洗涤后CaCl₂重悬，加入枯草芽孢杆菌tRNA，温和混匀，加入含有枯草芽孢杆菌基因组的培养基中，加入Fusion Buffer进行融合；所述Fusion Buffer含有PEG8000；

4）筛选得到融合子，将与异戊二烯合成有关基因导入融合子；

5）利用融合子发酵生产异戊二烯。

10.如权利要求9所述方法，其特征在于，步骤如下：

1）制备大肠杆菌宿主原生质体；

2）提取酿酒酵母基因组；

3）培养大肠杆菌原生质体浓度为5-50×10⁷CFU/mL，离心后Tris-NaCl洗涤一次，用200uL 0.1M CaCl2重悬，冰浴30min，加入10ug酵母tRNA，温和混匀，加入到400uL含有20uL酵母基因组的液体LB中，加入等体积Fusion Buffer，温和震荡1min，37℃下放置50min，加入10mL LB培养基，37℃下180rpm摇床培养3小时；Fusion Buffer组成为：Tris 20mM，NaCl 500mM，MgCl₂ 20mM，PEG8000 10%；

4）筛选得到融合子，将5uL pACY-mvaE-mvaS-gppS2-iSP4与5uL pTrc-low质粒转入100uL融合子感受态细胞中，得到重组融合子；

5）利用步骤4）得到的重组融合子发酵生产异戊二烯。