[发明专利]一种以甘油三酯为碳源的大肠杆菌及其在生物基化学品合成中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种以甘油三酯为碳源的大肠杆菌的构建方法及其构建得到的基因工程菌，以及利用该基因工程菌在以甘油三酯为碳源发酵生产目标产物的应用。

背景技术

废弃油脂是指餐饮业、食品加工业在生产过程中产生的不能再食用的动植物油脂，包括煎炸废油、泔水油和地沟油等。废弃油脂主要指常见的植物油、动物油两大剩余和排放的废弃油渣和泔水，据专家计算，这些废弃油脂的量约占食用油消费总量的20-30%。以我国年均消费食用油量为2100万吨计，则每年产生废油400-600万吨。目前，我国废弃食用油脂没有得到合理利用，相反，废弃食用油脂已成为一种环境污染物，并冲击食品安全。

废弃油脂的主要成分为甘油三酯，目前其主要利用技术是制备生物柴油（中国发明专利201210329282.0），但其成本过高，限制了生物柴油工业的发展。因此，探索餐饮废弃油高值化利用新途径具有十分重要的意义。从资源利用及经济合理性的角度看，把餐饮废弃油脂转化为高附加值产物是值得探索的研究方向。

发明内容

本发明提供了一种以甘油三酯为碳源的大肠杆菌，是将分泌型脂酶导入大肠杆菌得到的重组菌。

所述分泌型脂酶导入可以是通过载体导入宿主细胞，也可直接将分泌型脂酶整合到大肠杆菌染色体上，优选将分泌型脂酶整合到大肠杆菌染色体上。

所述编码分泌型脂酶的基因来源于真养产碱杆菌或与该基因具有类似功能的基因。

优选地，所述编码分泌型脂酶的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因来源于真养产碱杆菌H16（Alcaligenes eutrophus H16）或与该基因具有类似功能的基因。

所述大肠杆菌为已知常用大肠杆菌，优选大肠杆菌K-12或大肠杆菌BW25113，更进一步地，优选上述大肠杆菌为敲除了fadR基因的大肠杆菌。

本发明还提供了一种以甘油三酯为碳源的大肠杆菌的构建方法，是将分泌型脂酶导入大肠杆菌。

所述构建方法，步骤如下：

1）将脂酶基因连接到原核表达载体相应的多克隆位点上；

2）将该表达载体导入大肠杆菌。

上述大肠杆菌为大肠杆菌缺失突变株，通过如下方法改造得到：（a）采用Red重组敲除大肠杆菌基因组上的fadR基因，（b）采用翻转酶消除抗性标记。

本发明还提供了一种以甘油三酯为碳源的大肠杆菌用于生产发酵产品的应用，是将甲羟戊酸合成酶基因导入上述重组大肠杆菌。

具体而言，构建表达质粒pACY-mva（Yang et al.,2012PLOS ONE,7:e33509）。将表达载体pACY-mva通过传统的热激转化法转入上述大肠杆菌基因工程菌，利用得到的重组菌发酵生产甲羟戊酸。

本发明还提供以甘油三脂作为唯一碳源对大肠杆菌进行发酵的方法，包括（a）在适宜条件下培养大肠杆菌，活化菌株，（b）将大肠杆菌转接至添加甘油三酯的M9培养基中，（c）加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导脂酶的表达，（d）大肠杆菌利用外源甘油三酯生长。

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有益效果：

1）本发明所提供的工程大肠杆菌可以高效利用甘油三酯，而甘油三酯是废弃油脂的主要成分，因此，本发明提供的工程菌株为废弃油脂的再利用提供了一条新的途径；

2）大肠杆菌作为一种模式生物，其遗传背景清楚，易于进行基因操作，因此，与常见的废弃油脂降解菌株相比，本发明提高的大肠杆菌可以进行进一步改造，用于合成高附加值的化合物。

3）在本发明中，我们将甲羟戊酸合成的代谢途径与甘油三酯分解的代谢途径进行整合，实现了工程大肠杆菌利用甘油三酯直接合成甲羟戊酸，为废弃油脂的高值化利用提供了一条新的出路。

附图说明

图1pUC-slipase表达载体图谱。

图2pUC-slipase载体的酶切鉴定图；

（M：DNA分子量标记，1：对照质粒pUC19经HindIII和EcoRI双酶切，2：重组质粒pUC-slipase经HindIII和EcoRI双酶切）。

图3大肠杆菌fadR基因敲除的PCR验证图；

（M：DNA分子量标记，1：敲除fadR后菌株BW25113ΔfadR的PCR扩增图谱，2：对照菌株BW25113的PCR扩增图谱）。

图4不同菌株利用甘油三酯发酵的情况。